细胞因子诱导的肿瘤杀伤细胞（CIK）培养条件优化的研究

王茜婷，姚惟琦

（1.广东三九脑科医院神经医学研究中心，广东 广州 510510；2.武汉大学医学部，湖北 武汉 430071）

1 引言

大量研究表明，肿瘤患者外周血中存在的癌细胞，是引起肿瘤远端复发和转移的主要原因［1，2］。结肠癌肺转移同样为血源性转移。因此，通过清除血液中的癌细胞，从而抑制肿瘤的复发和转移，对延长肿瘤患者的生存周期，改善其生存质量，实现长期带瘤生存，有着重要的意义。

通过向患者体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法是一种不损伤机体免疫活性和功能的前提下直接杀死肿瘤细胞的生物治疗法。目前，已成为继手术治疗、放化疗、药物治疗之后快速发展的一种重要的肿瘤治疗的方法。其中，细胞因子诱导的肿瘤杀伤细胞（cytokine－induced killer cells，CIK）是将人外周血中分离出的单个核细胞通过多种因子共同培养之后获得的一群异质细胞，兼有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点［3］，且CIK细胞在现今发现的所有免疫细胞中具有最强的增殖能力和较强的细胞毒活性［4］。因此，CIK细胞免疫治疗被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗首选方案。

目前，免疫细胞治疗肿瘤应用日渐广泛，且取得了显著的疗效。樊永丽等通过比较65例胃癌术后化疗结合CIK治疗患者与130例单纯化疗的患者，经统计学结果分析，化疗联合CIK治疗组的3、5年无进展生存率、3、5年总生存率、中位生存时间以及中位无病进展时间均高于单纯化疗组［5］。Tao Yang等通过对42例晚期实体瘤患者进行DC－CIK治疗结果表明，所有的患者病情均有不同程度的改善，其中2例患者恢复至CR（影像学检查实体瘤消失），且42例患者肿瘤标志物检测结果较治疗前均有显著改善［6］。

本研究通过设计正交实验，选取临床常用因子的最优条件培养CIK细胞，评估其多项理化性质并结合临床应用，构建最优CIK培养体系，并初步探讨CIK细胞控制肿瘤血源性转移的可能性及对肿瘤细胞的杀伤能力。

2 材料与方法

2.1 试剂

注射用重组人白介素－2（IL－2）（辽宁卫星生物制品研究所），抗CD3单克隆抗体（德国Hyskill公司），RPMI1640培养基（奥地利PAA公司），人淋巴细胞无血清培养基（奥地利PAA公司），MTT（5mg/mL，美国Sigma公司）。

CIK制板液：人淋巴细胞无血清培养基，含有不同浓度的抗CD3单克隆抗体（100ng/mL，70ng/mL，50ng/mL）、注射用重组人白介素－2（IL－2）（1000IU/mL，700IU/mL，500IU/mL）、采血者自体血浆（0%，2%，5%）。

CIK工作液：人淋巴细胞无血清培养基，含有不同浓度的注射用重组人白介素－2（IL－2）（1000IU/mL，700IU/mL，500IU/mL）、采血者自体血浆（0%，2%，5%）。

2.2 肿瘤细胞株

人宫颈癌细胞株（Hela cell）。

2.3 效应细胞CIK的制备

使用密度梯度离心法分离一名结肠癌术后肺部转移患者的外周血50mL，制备成单核细胞悬液（PBMC），当天用30ml制板液将PBMC悬浮，取细胞悬液的1/20为一个实验组，共取9组，培养第3天加工作液扩增为原液的2倍，培养第5天用工作液2倍分盘扩增；培养第7天3倍扩增；培养第10天3倍扩增；培养第13天2倍扩增，培养第15天获得效应细胞CIK。

2.4 多条件培养效应细胞CIK正交实验

设计三因素三水平正交实验（三因素为制板液中单克隆抗体CD3，制板液和工作液中IL－2，制板液和工作液中自体血浆，三水平为CD3，IL－2，自体血浆所加入的不同浓度），共9个配比实验，见表1。

表1 L9（33）正交表

2.5 效应细胞CIK理化性质的测定

使用invitrogen公司的计数仪countess，分别测量效应细胞CIK 1～9的总数，存活率，活细胞总数，活细胞平均大小（average of valid cell size，AVCZ），死细胞平均大小（average of dead cell size，AVDZ）。

2.6 效应细胞CIK表型测定

使用流氏细胞仪分别测定效应细胞CIK 1～9中CD3＋CD8＋，CD3＋CD56＋所占比例，检测细胞总数大于1.0×106。

2.7 MTT法测定效应细胞CIK杀伤Hela活性

参考MTT法［7］，将效应细胞CIK与靶细胞Hela以效靶比为10∶1混合，接种于96孔板中，为实验组，另设单独靶细胞和单独效应细胞对照组，每组设5孔，将其置于37℃，5%的二氧化碳培养箱中，培养44h后，每孔加入MTT 20μl，共培养4h，弃上清，加入二甲基亚砜150μl每孔，摇床低速振荡10min，酶标仪测定各孔在492nm的吸光值，按下面公式计算杀伤率：

3 结果

3.1 多条件培养效应细胞CIK正交实验

设计三因素三水平正交实验，培养15天后获得效应细胞CIK共9组，理化实验结果如表2。

表2 1－9组效应细胞CIK理化实验表

根据双阳性细胞总数的结果对三因素三水平的正交实验进行结果分析，如表3。

分析正交实验结果，CD3的影响效果最显著。

分析正交实验结果，计算最优组合为：制板液中CD3的添加量为100ng/mL，制板液和工作液中IL－2的添加量为700IU/mL，自体血浆的添加量为2%。

3.2 优化后效应细胞CIK特性

根据正交实验所得最优培养条件组合，培养所得效应细胞CIK光学显微镜下细胞形态如图1，流氏细胞仪检测结果如图2。

表3 L9（33）正交实验复配结果

培养15天的效应细胞CIK细胞总数为6.3×107，存活率98%，活细胞总数为6.2×107，CD3＋CD8＋双阳性细胞比例为49.88%，CD3＋CD56＋双阳性细胞比例为48.00%，双阳性细胞总数为6.0×107.培养所得效应细胞CIK以效靶比为10∶1接种，MTT法测得其对Hela细胞杀伤活性为32.8%。

图1 效应细胞CIK光学显微镜形态图

4 结论与展望

恶性肿瘤转移是影响病人预后的重要原因，转移是个多步骤过程，其中，肿瘤细胞进入血循环后播散是一个重要环节［4］。彻底地清除血液中的癌细胞，能有效控制肿瘤的血源性转移。因此，回输CIK细胞的总量和有效细胞比率尤为关键。

细胞因子可以诱导CIK细胞成熟并和介导Thl型免疫应答［8］，经正交实验对培养条件优化后，CIK细胞的总数和双阳性有效细胞总数均有显著提高。本实验中原血供者在经过约500亿CIK细胞回输治疗且未采取任何其他治疗之后（每次回输100亿，每2个月回输一次），肺部转移病灶由1.3cm×0.9cm×1.1cm，减小至0.5cm×0.7cm×1.0cm，且患者的精神状态、睡眠、饮食、综合生活质量均有较明显的改善。

总之，本文对临床用CIK培养时最常用的因子单克隆抗体CD3、IL－2以及自体血浆进行正交实验优化后，得知CIK数量和质量均有不同程度的提高。通过MTT法杀伤活性实验更验证了CIK细胞的杀瘤能力。初步建立了临床用CIK细胞常规培养体系，有关更详细的作用机理仍待进一步研究。

图2 细胞表型检测结果

［1］Peck K，Sher YP，Shih JY，et al.Detection and quantitation of circulating cancer cells in the peripheral blood of lung cancer patients［J］.Cancer Res，1998，58（13）：2761.

［2］Funaki No，Tanaka J，Ohshio G，et al.Cytoketatin 20mRNA in peripheral venous blood of colorectal carcinoma patients［J］.Br J Cancer.1998，77（8）；1327.

［3］Schmidt－Wolf G D，Negrin R S，Schmidt－Wolf I G.Activated T cells and cytokine－induced CD3＋CD56＋ killer cells［J］.Ann Hematol，1997，74（2）：51－56.

［4］张嵩，王恩忠，白春学，徐永华.共培养的树突状细胞与CIK细胞治疗结肠癌血源性肺转移的实验研究［J］.肿瘤，2003，23（6）：448－451.

［5］樊永丽，赵华，于津浦，李慧，任宝柱，曹水，刘亮，李润美，张乃宁，安秀梅，任秀宝.胃癌患者术后化疗联合CIK免疫治疗的临床疗效［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2012，19（2）：168－175.

［6］Tao Yang，Ying Xiang，Yucheng Li，Jianghe Shao，Qiying Li，Huiqing Yu.Clinical study of co－treatment with DC－CIK cells for advanced solid carcinomas［J］.The Chinese－German Journal of Clinical Oncology，2011，10（6）：354－359.

［7］Dariasz，Sarah JS，Riehard H，Richard H.Clothier，Michael Balls.An improved MTT assay［J］.Journal of Immunological Methods，1993，157（1－2）：203－207.

［8］Shimizu K，Fidds RC，Giedlin M，et al.Systemic administration of interleukin 2enhances therapeutic efficacy of dendritic cell－based tumor vaccines［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1999，96：2268.