TLRs信号转导通路及负调控分子研究进展*

福建医科大学基础医学院 聂惠蓉 泉州师范学院生物学系 李裕红 福建医科大学基础医学院 刘迎春

Toll蛋白最早发现于果蝇胚胎发育过程中,在背腹侧体轴细胞的形成过程中起重要调控作用[1,2]。Toll样受体是一类病原相关模式识别受体（PRR），该家族与果蝇的Toll蛋白家族在结构上有高度同源性。TLRs广泛表达于哺乳动物等细胞表面，是一种跨膜信号转导蛋白。通过识别微生物的PAMPs或自身的内源性配体激活胞内信号通路，从而诱导产生促炎性细胞因子、趋化因子、干扰素和共刺激因子，在机体识别和清除病原微生物、介导下游细胞因子产生、天然免疫防御、连接先天性和获得性免疫中发挥重要作用。

1 TLRs的结构、分布及配体研究

1.1 TLRs的结构与在细胞内的定位

TLRs属于 I型跨膜受体，由胞外区、跨膜区和胞内TIL(Toll/IL-R1)区组成。胞外区富含亮氨酸重复序列，约550～980个氨基酸，可识别病原微生物的 PAMPs；跨膜区是富含半胱氨酸的区域；胞内TIL(Toll/IL-R1) 约有200个氨基酸,为所有TI R及 IL-l R分子胞内段所共有。该结构域可以与胞内其他带有相同TI R结构域的分子发生相互作用，启动信号传递，是信号传导的主要区域[3]。目前，在人体中相继发现了11个TLRs，即TLR1～11, 小鼠中不表达TLR10 但发现了人没有的 TLR11～13[4]。根据TLRs细胞内定位的不同，可将其分为两类，即位于细胞膜表面的TLR1、TLR2 、TLR4、TLR5、TLR6、TTLR11和位于细胞内细胞器膜 (如细胞内体、溶酶体或内质网膜) 的 TLR3、TLR7／8和TLR9。胞内细胞器膜的TIRs识别病毒和细菌的核酸。当细胞通过自吞噬作用将病毒粒子吞入细胞后，被细胞内体或溶酶体融合并将衣壳降解导致其核酸释放，从而被TLRs识别[5]。此外，研究证明，定位于胞内的 TLRs对于识别病毒 RNA、DNA和自身的RNA、DNA是十分重要的。例如，当 TLR9的跨膜区和胞质区与 TLR4发生替换时，产生的嵌合蛋白( TLR9N4C) 被置换到质膜上[6]。这种嵌合蛋白能够识别病毒和细菌的CpG DNA，却不能识别自身的DNA。值得注意的是，这种嵌合蛋白表达于巨噬细胞表面，这些细胞可以识别自身的DNA。由于对自身DNA的异常识别是引起自身免疫性疾病的原因。因此推断，TLR定位于胞内可防止自身免疫性疾病的发生。

1.2 TLRs的配体

TLRs的基因分散地分布在不同的染色体中，其中TLR1、TLR2、TLR3和TLR6基因定位于4号染色体，TLR4和TLR5基因分别定位于9号和1号染色体，TLR7和TLR8基因定位于染色体Xp22，TLR9基因定位于3p21.3。TLR11为 TLRs家族新成员，主要表达于泌尿系统。TLRs的配体按其来源可分为内源性和外源性配体（见表 1）。内源性配体主要是宿主的成分, 如热休克蛋白、细胞外基质降解成分等。外源性配体主要是微生物进化过程中的保守成分, 如细菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及细菌和病毒的核酸等。

表1 TLRs的配体及其来源[3～7]

2 TLRs的信号转导通路

Toll样受体可在多种免疫细胞中表达，如单核细胞／巨噬细胞、中性粒细胞、 树突状细胞及未成熟树突状细胞，还可在血管内皮细胞、心肌细胞和肠上皮细胞表达。TLRs 识别并结合 PAMPs 或内源性配体导致下游信号事件和转录因子的激活，从而诱导抗微生物分子、化学趋化因子、细胞因子和共刺激分子的表达。据研究报道，主要有两条信号通路途径，一是依赖于髓样分化因子88（MyD88）信号转导途径，另一是非依赖于髓样分化因子88（MyD88）信号转导途径。除 TLR3外，所有的TLRs都可以通过MyD88介导下游的信号转导。

2.1 MyD88依赖的TLRs的信号转导途径

My D88是一种35k Da的胞浆内蛋白质，为TLRs信号途径中普遍存在的接头分子，同时也是 TIR／IL-1R超家族的重要成员之一。它的C端含TIR结构域，与TLRs胞内区的TIR结合，N端则是死亡结构域( death domain，DD) 。TLRs与 My D88的结合后，招募 IRAKs (interleukin receptor associated kinase )家族，包括 IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK-M。其中IRAK4是激活依赖于MyD88不可缺少的关键分子[8,9]，一旦IRAK4被磷酸化，就会与MyD88分子分离，进而与TRAF6 (TRAFs家族成员)发生相互作用。TRAK1与TAB1、2、3结合活化两条下游途径，其中包IKK ( IKBkinase )复合体和MAPK( mitogen-activated protein kinase )家族。IKK复合体由具有催化作用的IKK-d、IxB、IKK-p和IKK-y/NEMO亚基组成，它可以催化IкB蛋白磷酸化。这种磷酸化可引起IкBs的降解以及NF-кB的激活是不可或缺的；而MAPKs的磷酸化则激活转录因子AP-1( activator protein-1 )。AP-1是来源于Jun、Fos、ATF和Maf等分子的一段富含亮氨酸的二聚体，而c-Jun基因在TLRs激活炎性细胞因子的信号转导通路中起到重要作用。对来源于TAK1缺陷性小鼠的细胞研究发现， TLRs信号通路中的NF-кB与MAPKs的激活受到抑制，炎性细胞因子的表达也进一步下调[10]。这表明，AK1在NF～кB与MAPKs活化的信号转导通路中起到不可替代的作用，但TAK1 ( TGF-b-activated kinase1)如何活化IKK复合体和MAPKs，却仍然不清楚。

对 TAK1泛素化的研究发现，尽管 Ubcl3 ( ubiquitinconjugating enzyme )与 NF ～кB 和 MAPKs 的激活有关，但在Ubc l3缺陷型小鼠，它对NF～кB 的激活可有可无。Ubc l3缺陷型巨噬细胞，在各种TLRs 配体刺激下显示出缺乏产生炎性细胞因子的能力，即MAPKs的激活受到抑制，而NF ～кB的激活却未受到影响，这表明Ubcl对MAPKs的激活是必要的。值得关注的是，Ubcl3的缺乏对TAK1的活化和TRAF6的泛素化不产生影响。在TLRs通路中，由于TAK1和TRAF6对MAP Ks和NF ～кB的激活十分重要。因此，推断Ubcl3对 MAPKs 激活通路是不依赖于TAK1和TRAF 6，它位于TAK1/TRAF6的下游。在Ubc l3缺陷型细胞中，当Ubc l3缺乏时，Ubc 5就会激活NF ～кB，特别是 IKK- 7/NEMO的泛素化显著降低。这预示依赖于 Ubcl3的 IKK-7/NEMO( NF～кB essential modulator )的泛素化和MAPKs的活化之间存在一定的联系[11]。

除 TAK1之外，还有其他的MAPKs与TLR4信号通路有关。当受到LPS刺激后，MEKK3缺陷型巨噬细胞并不能激活JNK和p38产生IL-6[12]。与之相反，虽然Tpl-12缺陷的巨噬细胞受到LPS刺激后ERK的活化与TNF-α的表达受到严格的抑制，但能够激活，JNKs ( c- Jun N-terminal kinases )和p38。研究表明，ABIN2 (一种捆绑A20分子的NF ～кB抑制剂) 能稳定Tpl-12对ERK的激活。对ASK1缺陷型脾细胞和DC的研究表明，p38活化以及IL-6、TNF-α 的分泌受到抑制。LPS刺激ROS的表达与TRAF6-AS K1- p 38 信号通路的建立有关[13]。总之，MAPKs的激活决定了TLR4介导的炎症反应。

2.2 MyD88非依赖的TLRs的信号转导途径

MyD88基因敲除鼠在应答TLR2、TLR7和TLR9配体时未发现NF ～кB和JNK的活化。然而，关于TLR4的刺激，虽然MyD88基因敲除的细胞在应答LPS时不产生任何炎症细胞因子，但却可以观察到LPS诱导的NF ～кB和JNK的延迟活化。Kawai等[14]分别从有LPS刺激和无LPS刺激的敲除MyD88基因的巨噬细胞中提取mRNA，发现存在LPS刺激时，MyD88基因敲除细胞有 IFN诱导的基因的表达，如IP-10和GARG16。后来的系列研究充分证实，存在MyD88依赖和MyD88非依赖两条TLRs信号途径。在MyD88非依赖信号途径中，LPS的刺激，使转录因子干扰素调节因子 3( interferon regulate factor 3，IRF3 )活化，诱导IFN-13表达。IFN-13再依次激活Statl, 进而导致几个IFN诱导的基因的表达[15]。

研究显示，在MyD88基因敲除细胞，除 TLR4配体，TLR3配体dsRN A亦可活化NF ～кB。病毒和病毒衍生dsRNA是IRF -3的有效激活子，活化的IRF-3启动IFN-β基因表达。故TLR3配体dsRNA能激活MyD88非依赖途径，在此途径中，IRF-3发挥着重要作用。那么哪些激酶负责IRF-3的活化呢? Sharm等[16]采用酵母双杂交技术筛选了与IRF-3相互作用的分子，发现 IRF-3 和 IкB 激酶 ( IкB kinases，IKKs )密切相关。IKKs由IKKα和IKKβ组成，两者均磷酸化IкBα的Ser32和Ser36，诱导NF～кB活化。此外，有两个非经典的IKKs：TRAF 联合 NF～кB 激酶( TRAF joint NF ～кB kinase，TANK) 结合激酶1 (TANK-binding kinase 1,TBK1 )和IKKε／IKKi 。与经典的IKKα和IKKβ比较，具有不同的激酶活性。体外激酶分析发现TBK1和IKKε／IKKi能够诱导IRF-3磷酸化；用RNA干扰介导技术删除TBK1和IKKε／IKKi 后，病毒诱导的IRF-3磷酸化则被抑制。Fitzgerald和同事[17]也发现 TBK1和IKKε／IKKi 能活化IRF-3、诱导IFN-β表达；当通过RNA干扰作用降低TBK和IKKε／IKKi 表达，则发现应答病毒和dsRNA时，IFN-β表达受损。所以，应答TLR3配体时，TBK1和IKKε／IKKi发挥关键作用。值得注意的是，K63多泛素作用在IRF活性中同样发挥重要作用， Zeng等[18]研究发现内源性泛素 K63R突变会导致病毒活化的 IRF3失活。

3 TLRs信号通路中的负性调控因子

TLRs的激活一方面可刺激先天性和获得性免疫反应来保护机体，但另一方面如引起持续炎症反应则会对机体产生损伤。自身免疫、慢性炎症和感染性疾病均与它有一定的关系。例如LPS持续刺激TLR4会产生严重的败血症和感染性休克。此外，类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺心病、结肠炎、哮喘、肌病、红斑狼疮和动脉粥样硬化等也与TLRs的激活有关。因此，TLRs的激活必须受到严格的负向调控，以保持机体免疫系统的稳定[19]。

3.1 ⅠRAK-M和 Tollip分子

适当的炎症反应可以有效地清除入侵的病原微生物保持机体健康，但是免疫系统过度活化对机体有害无益，在某些情况下超量的细胞因子会引发严重的炎症反应, 引起组织损伤甚至循环衰竭, 导致死亡。如上所述，IRAK-M 通过抑制IRAK与TLR受体复合物的解离，对巨噬细胞 TLRs活化信号起负调控作用。除此之外，静息细胞中Tollip分子与IRAK形成复合物，可通过抑制IL-1和TLRs介导的IRAK磷酸化抑制细胞活化[20,21]。

3.2 MyD88s 分子

MyD88s ( MyD88 short)是MyD88分子的差异剪切体，主要表达在脾细胞，单核细胞受LPS刺激后，可上调MyD88s的表达。MyD88s虽可结合IL-1R和IRAK，但不能诱导IRAK磷酸化和随后的 NF～кB活化；相反，它能阻止 IRAK-4与TLR受体复合物的结合，对TIRs和IL-1活化信号起负调控作用[ 22 , 23 ]。

3.3 SⅠGⅠRR 分子

SIGIRR (Single immunoglobulin IL -1R-related molecule)又称 Tir8 (Translationiniia-tionregion8), 基因定位于染色体11p15.5，为单链Ig / I L-1R相关受体超家族成员，含 Ig和TIR两种功能域,但 TIR中无传递信号所必需的保守氨基酸Ser 447和Tyr536[8]。SIGIRR主要表达在上皮细胞和树突状细胞，高表达SIG IRR的293细胞能有效抑制IL -1和IL -18诱导的NF～кB报告基因转录活性；SIGIRR基因缺陷可使LPS和CpG诱导 DC分泌更多的细胞因子和趋化因子，但对TNF-α诱导的DC活化无影响。因此它是 TLR / IL-1R的负性调控因子, 并主要在调控胃肠道系统的炎症反应中起重要作用[24]。IL-1作用于细胞后，SIGIRR与 IRAK 和TRAF6结合，提示SIGIRR通过与IL-1受体复合物结合发挥负性调节作用[25]。相对于IRAK-M、tollip和MyD88s等TLRs信号的胞内抑制性分子, SIGIRR为胞外抑制性分子，因此胞内以及胞外抑制性分子之间的协同作用，共同对 TLRs活化进行精细的调节。

3.4 其他的负调节分子

除上述分子，PI 3-K( Phospho inositide 3 -kinase)和SOCS-1( Suppressor of cytokine signaling -1）也参与对 TLR 信号的负调节[26]。PI 3-K是 TLR2诱导IL-12分泌的内源性抑制分子，在细胞中组成性表达, 被认为在TLR信号的早期阶段或第一次接触病原体时发挥作用；而IRAK-M 和SOCS-1可被TLR诱导表达，因此在二次刺激或病原体持续存在时发挥负调节作用，与LPS耐受的形成有关。机体还可通过下调细胞TLR4表达水平诱导 LPS耐受，降低对LPS的反应性[27]。

4 小结

当病原微生物感染时，机体的TLRs通过复杂的、多层次的调控来实现其介导的信号转导。首先，TLRs与胞内的接头分子相互作用激活多条信号转导通路， 启动机体的先天性免疫反应和促进获得性免疫反应，产生炎症反应，清除病原微生物。其次，机体通过启动自身的负向调控系统来抑制TLRs信号转导通路，使机体恢复免疫平衡。深入研究 TLRs的结构和信号转导途径，以及它们与免疫细胞的相互作用，探讨可能的干预及治疗措施，可为相关疾病的临床治疗和用药提供新的靶位点。

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