HPLC法测定猪尿酸酶活性

陈 思，李 辉，马娇颖，谢光蓉，陈建华

(中国药科大学生命科学与技术学院分子生物学教研室，江苏 南京 210009)

尿酸酶(Uricase，EC 1.7.3.3)是一种以氧作为受体的氧化酶，能够催化尿酸氧化生成尿囊素、CO2和H2O2。大多数哺乳动物和禽类体内含有尿酸酶，可将核酸组成单位中嘌呤核苷酸代谢的产物尿酸分解成尿囊素，而人和猿类体内缺乏尿酸酶，所以以尿酸形式直接排出体外。尿酸及其盐类在水中溶解度很低，在某些病理情况下，由于嘌呤代谢紊乱，血液中尿酸积累过多，会导致高尿酸血症，继而引发痛风综合症。尿酸酶可以将尿酸氧化成尿囊素，从而降低痛风病人体内的尿酸水平，进而消除痛风病人痛风性关节炎、痛风石沉积及尿酸肾结石形成等症状[1]。

目前测定尿酸酶活性的方法主要是紫外分光光度法，该方法虽操作方便，但存在检测线性范围窄、测量结果易受反应体系杂质的干扰等不足。作者在文献[2]的基础上，对其进行改进，建立了HPLC法测定猪尿酸酶粗酶液活性，为尿酸酶活性研究奠定了基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

重组猪尿酸酶基因工程菌，自行构建。

甲醇，色谱纯；硼酸、硼砂、高氯酸、磷酸，分析纯；尿酸，化学纯，美国Fisher Scientific Co.。

高效液相色谱仪，岛津；离心机；细胞破碎仪；UV1100型紫外分光光度计；万分之一天平；pH计；10 kD超滤管，美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

硼酸-硼砂缓冲溶液：称取硼砂4.2908 g、硼酸3.4018 g，定容于500 mL容量瓶中，调pH值至8.4。

终止液：取1 mL 75% 的高氯酸溶液加至10.6 mL去离子水中，终浓度为1 mol·L-1。

尿酸标准溶液：精密称取0.0168 g尿酸于100 mL容量瓶中，用缓冲溶液定容，终浓度为1 mmol·L-1。

粗酶液：从重组猪尿酸酶工程菌斜面接一环菌苔于50 mL LB培养基中，于37 ℃、200 r·min-1摇床培养至OD值0.4左右，加IPTG(终浓度1 mmol·L-1)诱导6 h后，于12 000 r·min-1离心3 min；将菌体重新悬浮于生理盐水，离心洗涤3次；将菌体悬浮于硼酸-硼砂缓冲溶液，超声破壁5 min，于12 000 r·min-1离心10 min，取上清，即得粗酶液。

1.2.2 样品处理

对照样品：取750 μL尿酸溶液，加入600 μL终止液，再加入150 μL粗酶液，冰浴5 min，离心(12 000 r·min-1) 2 min，取上清500 μL移至超滤管中于12 000 r·min-1离心10 min，取滤出液20 μL进样检测。

检测样品：取750 μL尿酸溶液，加入150 μL粗酶液，在37 ℃水浴反应5 min，然后加入600 μL终止液，冰浴5 min，离心(12 000 r·min-1) 2 min，取上清500 μL移至超滤管中于12 000 r·min-1离心10 min，取滤出液20 μL进样检测。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C18;流动相：磷酸3 mL，甲醇25 mL，加超纯水定容至500 mL，体积比为3∶25∶472，过滤后使用；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：292 nm；柱温：20 ℃；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

将1 mmol·L-1的尿酸溶液用缓冲溶液依次稀释至500 μmol·L-1、400 μmol·L-1、300 μmol·L-1、200 μmol·L-1、100 μmol·L-1、10 μmol·L-1,每个浓度进样20 μL检测，记录峰面积。以尿酸浓度(x)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。

图1 HPLC法测得尿酸溶液的标准曲线

由图1可看出，底物尿酸在10～500 μmol·L-1范围内线性关系良好。

2.2 方法专属性

2.2.1 超滤吸附实验

分别取200 μmol·L-1与300 μmol·L-1尿酸溶液各500 μL，移至超滤管中于12 000 r·min-1离心10 min，取滤出液20 μL进样检测，记录峰面积，与超滤前的尿酸溶液进行比较，计算得到回收率分别为101.80%和99.33%。表明超滤后尿酸浓度只有轻微变化。

2.2.2 缓冲溶液与终止液干扰实验

取200 μmol·L-1尿酸溶液500 μL，分别加入等体积的双蒸水、缓冲溶液、终止液，混匀后取20 μL进样检测，结果见图2。

图2 缓冲溶液与终止液干扰实验结果

由图2可看出，缓冲溶液与终止液对检测结果没有干扰。

2.2.3 粗酶液干扰实验

取200 μmol·L-1的尿酸溶液750 μL，依次加入600 μL高氯酸溶液与150 μL粗酶液，混匀后冰浴静置5 min，取上清500 μL移至超滤管中，于12 000 r·min-1离心10 min，取滤出液20 μL进样检测，记录峰面积；再取200 μmol·L-1尿酸750 μL，加缓冲溶液750 μL，混匀后进样检测，记录峰面积；另设一组空白对照，方法是取750 μL缓冲溶液，加入150 μL粗酶液、600 μL高氯酸溶液，冰浴5 min，取上清500 μL移至超滤管中，于12 000 r·min-1离心10 min，取滤出液20 μL进样检测。结果见图3。

(a)加粗酶液 (b)不加粗酶液 (c)空白对照

由图3计算可知，回收率为103.98%。表明加入粗酶液的反应体系经高氯酸与超滤处理后，其残留杂质对检测结果干扰较小。

2.3 精密度与稳定性

2.3.1 精密度

将300 μmol·L-1的尿酸溶液重复进样6次，峰面积分别为1 452 821、1 453 349、1 454 144、1 453 528、1 453 182、1 453 194，相对标准偏差(RSD)为0.03%。表明检测精密度良好。

2.3.2 稳定性

取200 μmol·L-1的尿酸溶液750 μL，依次加入600 μL高氯酸溶液、150 μL粗酶液，混匀后冰浴静置5 min，于12 000 r·min-1离心5 min，取上清保存一周后进样检测，再按同样方法配制新鲜样品进样检测，结果见图4。

(a)新鲜样品 (b)放置一周后样品

由图4可计算出，回收率为99.66%。表明样品稳定性良好。

2.4 与传统的紫外分光光度法对比

将1 mmol·L-1的尿酸溶液用缓冲溶液依次稀释为20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1、50 μmol·L-1、60 μmol·L-1，每个浓度取3 mL 用紫外分光光度计检测，记录292 nm处的OD值。以尿酸浓度(x)为横坐标、OD值(y)为纵坐标，绘制标准曲线，见图5。

图5 紫外分光光度法测得尿酸溶液的标准曲线

取40 μmol·L-1的尿酸溶液2.5 mL加500 μL粗酶液，37 ℃反应5 min，记录反应前后的OD值，两种方法所求得的反应初速度见表1。

表1 紫外分光光度法与高效液相色谱法结果对比

由表1可看出，两种方法检测结果相近，但是粗酶液中有些杂质会干扰紫外分光光度法的检测结果，相对而言高效液相色谱法的检测结果更准确。

2.5 讨论

HPLC法测定重组猪尿酸酶基因工程菌发酵液酶活性的主要原理是：利用高氯酸和超滤将反应体系中的大分子除去，以直接检测底物尿酸的含量，这样可以避免堵塞进样器、破坏色谱柱以及干扰检测结果。之前也有相关文献报道了HPLC检测血液尿酸酶活性的方法，其中高氯酸被认为可以除去血清中大部分蛋白质[3]；而Millipore超滤管原本是用作浓缩蛋白和脱盐的[4]，但也有相关文献报道它可以用来除去一些大分子[5]，本实验将这两种方法相结合除去反应体系中的大分子，而空白对照实验表明体系内的其它杂质对尿酸检测没有影响。

3 结论

建立了一种测定重组猪尿酸酶活性的高效液相色谱方法。结果表明，尿酸在10～500 μmol·L-1范围内线性关系良好,样品回收率在99%～104%之间。该方法比紫外分光光度法更精确、具有更广的线性范围，且操作简单、灵敏度高、专属性好，适于尿酸酶活性的检测。为进一步研究尿酸酶提供了方法学基础。

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[4] 李超,林菊生,陈孝平,等.人肝癌组织α-L-岩藻糖苷酶的提取和鉴定[J].世界华人消化杂志,2005,13(9):1089-1093.

[5] 罗楠，刘放南,万秀珍,等.反相高效液相色谱法测定大鼠头孢氨苄血药浓度[J].医学研究生学报,2006,19(9):783-787.