广东省猪大肠杆菌优势血清型O107外膜蛋白的提取

王文豪，张丹琳，苏丹萍，贺东生

（华南农业大学兽医学院 广东省人畜共患病重点实验室，广东 广州 510640)

猪大肠杆菌是条件性致病菌，可终年使猪群发病，且各年龄段的猪均可发病，尤其对仔猪的危害异常严重。多年来，对于大肠杆菌病的防控主要是通过接种灭活苗的方法进行的。这种方法固然起到一定的效果，但由于大肠杆菌血清型众多，不同菌株的交叉免疫保护力低下。因此，灭活苗不能在很大的范围内推广应用。而大肠杆菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，且对不同菌株有交叉保护能力，是一种良好的保护性抗原[1-2]。外膜蛋白疫苗将会有较好的发展前景。本实验从广东省猪大肠杆菌优势血清型O107中，选出一株有致病性的菌株，并对该菌株的外膜蛋白进行抽提，以期为外膜蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

肠致病性大肠杆菌O107由华南农业大学兽医学院传染病教研室分离鉴定得到。

1.2 主要化学试剂

2%的十二烷基肌氨酸,纯度≥95%,分析纯,过硫酸铵,sigma 公司产品。10 mmol/L的HEPES(N-2-羟乙基哌嗪- N′-2-乙磺酸),pH7.4,纯度≥99%，分析纯,丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺,Amresco 公司产品。Tris、溴芬兰、甘油、β-巯基乙醇等其他试剂均为国产试剂，低分子质量蛋白Marker购买于Bio-Rad公司。

1.3 主要仪器

超速离心机，型号为BECKMANL8-M ,贝克曼产品。高速冷冻离心机( 6K15)，购于Sigma公司。超声波细胞粉碎仪(FS300)，购于上海生析超声仪器有限公司。气浴恒温振荡器(摇床)，SHZ-82型，江苏金坛中大仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 OMP 的提取

将菌株接种于普通营养琼脂平板上,37 ℃培养18～24 h；挑取单个菌落接种于6 mL营养肉汤中，37 ℃振荡培养18 h；培养物以4 ℃、6 000 g离心10 min；将沉淀悬浮于5 mL HEPES(10 mmoL/L，pH 7.4 )中，78 W超声裂解10 min;裂解物4 ℃、6 000 g离心10 min，弃去上清液；加入约5倍体积的2%N-十二烷基肌氨酸钠室温作用30 min，分装于30 mL超速离心管中，10 ℃、110 000 g离心1 h；将沉淀悬浮于0.5 mL HEPES(10 mmoL/L，pH值7.4)中,置-20 ℃保存，备用。

1.4.2 电泳检测

1.4.2.1 SDS - PAGE 将上述外膜蛋白样品15μL与等量样品缓冲液混合，100 ℃水浴加热5 min，加样品于垂直电泳槽的样品孔中，恒压90 V电泳。样品缓冲液为含4%SDS，20 %甘油,5%β-巯基乙醇，0.002 %溴酚蓝的0.1 mol/L Tris HCl(pH6.8)。

1.4.2.2 考染 凝胶剥离后，用染色液(0.25%考马斯亮兰- R250、10%冰醋酸、50%甲醇)染色大约4 h后,用脱色液(5%甲醇、7%冰醋酸)振荡脱色至条带清晰背景干净透明为止,拍照。

2 结果

大肠杆菌O107OMP的SDS - PAGE考染结果(见图1)。

由图1可见，菌株OMP条带大致集中于31～37 ku之间， 菌株呈现2 条带,这与报道的畜禽大肠杆菌主要OMP分子质量相符，说明该实验成功地提取了大肠杆菌外膜蛋白。

3 讨论与分析

1）本实验主要参考了高崧等报道的禽源性大肠杆菌OMPs 提取方法,对猪致病性大肠杆菌O107的OMPs 进行初步提取试验。外膜蛋白是重要的毒力因子，试验证明，抽提的外膜蛋白与基因工程表达出来的外膜蛋白都具有良好的免疫原性。本试验针对广东地区猪大肠杆菌优势血清型O107的OMP做了初步提取,以期为OMP亚单位疫苗的研制的进一步研究提供基础性材料。

图1 E1coli OMP考染电泳图

2）近年来的试验研究表明，通过血清型鉴定试验虽然可以给大肠杆菌分型，但此种方法不能反映不同大肠杆菌分离株之间的遗传相关性,而外膜蛋白可反映病原性大肠杆菌分离株的遗传标志。同一血清型的菌株可能属于不同的外膜蛋白型，而不同血清型的菌株也可能属于同一外膜蛋白型[3]。本实验中猪大肠杆菌优势血清型O107的OMP有2个条带，外膜蛋白型为2型，是否广东地区流行的血清型O107其他菌株也具有2条带或不同的条带数尚需进一步研究。

[1] 高崧，刘秀梵，张如宽.一种快速提取禽源性大肠埃希氏菌外膜蛋白的方法[J].微生物学通报,1996,23(2):122-124.

[2] 高崧，等.我国部分地区禽源性大肠杆菌的外膜蛋白型[J].微生物学报,1999,39(3):226-233.

[3] 丁伯良，鄢明华，王英珍，等.天津地区鸡致病性大肠杆菌血清型分布及其优势血清型的外膜蛋白型研究[J].动物医学进展，2003,24（2）：94-96.