猪圆环病毒2型CC株ORF3基因序列分析及真核表达

黄文明，徐廷川，张亮权，张得玉，张民泽，张桂红

（华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种无囊膜的单股负链环状DNA病毒。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndromme，PMWS）的主要病原，成为危害养猪生产的重要病原之一。

Hamel等［1］应用软件对PCV基因组进行了分析，发现PCV基因组含有11个潜在的开放阅读框（ORF），ORF1、ORF2为主要阅读框，ORF1编码与病毒复制相关的蛋白（Rep），ORF2编码病毒的主要结构蛋白（Cap）。近年来，针对PCV2基因功能的研究主要集中在ORF1和ORF2基因［2］。ORF3基因为近两年来新鉴定的一个具有重要功能的基因，其编码的蛋白对病毒在细胞培养物中的复制是非必须，但介导PCV2诱导的细胞凋亡［3］。

本试验从疑似PMWS的死亡仔猪组织病料中扩增得到了ORF3基因并对其进行了序列分析，成功的表达重组pEGFP-N2-ORF3蛋白，为进一步研究PCV2在华南地区的分子流行病学、遗传变异及防治奠定了基础。

1 材料

1.1 病料 广东省佛山市某猪场送检病料（断奶仔猪的脾、淋巴结、肺等），-70℃ 保存备用。

1.2 质粒、菌株和试剂 大肠杆菌JM109、BL21由华南农业大学兽医学院传染病研究室保存；pEGFP-N2真核表达载体购自CLONTECH公司；DNA提取试剂盒、限制性内切酶Eco R I和Xho I、DNA Marker DL-2000均为宝生物工程（大连）有限公司产品；E.Z.N.A.Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit为OMEGA公司产品；其他常规试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 引物 根据GenBank中PCV2的核酸序列，设计一对扩增ORF3的引物，并在上、下游引物分别加入Eco RⅠ和SalⅠ的酶切位点。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

上 游 引 物 A：5′-CTCGAGATGGTAACCATCCCACCACTTG-3′

下游引物 B：5′-GAATTCTTACTGATAGAATGTGGAGC-3′

1.4 模板的制备 取少量死亡猪组织病料充分研磨制成悬浮液，反复冻融3次，10000r／min离心取上清，用DNA抽提试剂盒提取DNA，取适量用作PCR模板。

1.5 ORF3片段的PCR扩增 采用20μL体系：灭菌双蒸水13.5μL；10×PCR Buffer（Mg2＋Plus）2μL；2.5mmol／L each dNTP Mixture 2μL；上、下游引物各0.5μL；TaKaRa TaqTMDNA 聚合酶0.25μL；DNA 2μL。扩增条件：95℃5min预变性；然后95℃1min，53℃30s，72℃40s，30个循环，72℃6min。1%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.6 PCR产物的克隆 回收上述PCR产物，用Eco RⅠ和SalⅠ对获得的PCR回收产物进行双酶切，酶切后连接到pMD18-T载体上；转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取重组克隆质粒，经PCR和酶切鉴定，筛选阳性克隆测序并进行序列分析。

1.7 重组表达载体的构建 双酶切重组克隆质粒后将获得的ORF3片段与双酶切后的pEGFP-N2载体连接、转化；通过酶切和PCR筛选、测序鉴定含目的片段的重组子，并命名为pEGFP-N2-ORF3。

1.8 转染用质粒的提取 使用OMEGA无内毒素大提质粒试剂盒提取，按说明书操作。

1.9 细胞转染 将正常培养的PK15细胞用胰酶消化，800r／min离心5min，去上清，细胞用无抗生素无血清的RPMI 1640培养液重悬。将细胞以2×105／孔接种于预置玻片的24孔板中，37℃培养。待细胞生长到占玻片约70%～80%时，进行转染。转染过程根据Invitrogen转染试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 ORF3目的片段扩增 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，可见一条约315bp的条带，该条带的大小与目的片段ORF3的预期大小相符（图1）。

图1 ORF3基因的PCR扩增产物

2.2 同源性比较及序列分析 测序得知，克隆于重组质粒中的ORF3基因长315bp，与预期相符，它编码105个氨基酸（图3），该基因在GenBank中的登录号为BAA88133。将该基因与GenBank中的PCV2 毒 株 （AF055392、AF055394、EU148503、AY181946、EF524532、AF364094，毒株均为 PCV2分型标准株）的ORF3基因核苷酸及推导氨基酸序列进行了同源性比较。结果显示，PCV2 CC株ORF3的核苷酸序列与参考毒株的相似性为96.2%～99.0%，推导的氨基酸序列同源性为90.5%～98.1%（表1）。同时还可以看出，PCV2 ORF3C-端都含有大量的亲水性氨基酸（Ser）且较为保守（图3）。

图2 PCV2CC株ORF3基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列

表1 PCV2CC株ORF3与参考株ORF3基因核苷酸和氨基酸序列的同源性比较 （%）

图3 PCV2ORF3基因推导的氨基酸序列比较

2.3 ORF3真核表达载体的构建及鉴定 重组的pEGFP-N2-ORF3经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切，和PCR鉴定，结果表明，Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切可以切出和315bp的DNA片段。用引物A和B作扩增，可获得约315bp的目的片段（图4）。

2.4 细胞转染 将pEGFP-N2-ORF3融合表达载体和pEGFP-N2载体分别转染COS-7细胞，激光共聚焦显微镜观察蛋白表达情况。pEGFP-N2转染细胞于培养后5～6h在细胞内可见分布均匀的亮绿色荧光（图5-a），且随培养时间的延长细胞不出现死亡；而转染pEGFP-N2-ORF3的细胞均于转染后7～8h出现荧光（图5-b），继续培养至38h荧光细胞的数量明显减少，荧光细胞大量死亡后飘浮在细胞生长液中。与对照组相比，试验组许多细胞收缩，细胞内出现空泡，细胞膜发泡，细胞的染色质浓缩，并靠近核膜，有核着边现象，核膜裂解、染色质分割成块状，晚期形成凋亡小体，并从皿底脱落、死亡。

图4 重组质粒pEGFP-ORF3的酶切鉴定

图5 pEGFP-N2-ORF3在COS-7细胞中的表达 （10×）

3 讨论

本试验选用疑似PMWS的死亡仔猪组织病料，应用PCR技术成功的扩增了ORF3基因，通过克隆与测序，发现与其他PCV2毒株的ORF3核苷酸序列相似性为96.2%～99.0%，推导的氨基酸序列同源性为90.5%～98.1%，其中与AF055392-ORF3a和AF055394-ORF3b的核苷酸序列同源性为99.0%，氨基酸序列同源性为98.1%，同源性相对较高，说明CC株可能属于其中一个亚型；而与AF364094-ORF3f的核苷酸序列同源性为97.8%，氨基酸序列同源性为94.3%，同源性相对较低，可能与这些毒株的分离地点不同有关，也就是说PCV毒株存在地区差异性［4］。从总体情况来看，PCV2的ORF3基因变异相对较大，有些毒株之间的ORF3核苷酸及推导的氨基酸序列同源性仅为96.2%和90.5%，变异散布于整个ORF3，这些差异可能与ORF3介导的细胞凋亡速度有关，须进一步试验研究。

近年来，已经有不少学者关于Rep蛋白感染细胞定位的研究，Gilpin等［5］用PCV2感染PK15细胞后，发现Rep蛋白主要位于细胞核，但是很少对ORF3编码蛋白产物进行细胞感染定位。本试验成功构建了重组质粒pEGFP-N2-ORF3，将pEGFP-N2-ORF3转染COS-7细胞，在细胞核和细胞浆内可见分布均匀的亮绿色荧光，尤其在细胞核中表达量较高，而在38 h后部分细胞死亡后漂浮于细胞液上，表明融合表达的ORF3编码产物对细胞有毒性作用，能够加速细胞死亡，与李增魁的报道一致［6］。ORF3重组蛋白的成功表达为研究ORF3编码蛋白的生物学活性及病毒感染的致病的分子机理、病毒遗传变异特征等领域的深入和系统研究奠定了基础。

［1］Hamel A L，Nayar G P.Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs［J］.J Virol，1998，72：5262-5267.

［2］林彦星，孙彦伟，刘镇明，等.猪圆环病毒II型ORF2截短基因的克隆及原核表达 ［J］.中国兽医学报，2007，27（4）：464-468.

［3］Liu J，Chen I，Kwang J.Characterization of a previously unidentified viral protein in Porcine circovirus type 2-infected cells and its role in virus-induced apoptosis［J］.J Virol，2005，79（13）：8262-8274.

［4］卢银华，陈德胜，华修国，等.猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建 ［J］.中国病毒学，2002，17（1）：87-91.

［5］Gilpin D F，Mc Cullough K，Meehan B M，et al.In vitro studies on the infection and replication of porcine circovirus type 2 in cells of the porcine immune system ［J］.Vet Immunol Immunopathol，2003，94（3-4）：149-161.

［6］李增魁.猪圆环病毒2型ORF3编码蛋白的体外表达［J］.畜牧与兽医，2008，40（9）：25-30.