细辛提取物对茄子黄萎病及茄子生长与抗性生理指标的影响

周宝利姜春云陈志霞李腾飞宋岩

（沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳 110161）

茄子黄萎病（Verticillium dahliae）又称半边疯、黑心病、凋萎病，是茄子（Solanum melongenaL.）的重要病害（王建平 等，2011），世界各地都有发生。茄子黄萎病是由大丽轮枝菌（VerticilliumdahliaeKleb）引起的世界性土传病害，生产中由于保护地连作、施肥等原因使黄萎病逐年加重，极大地影响了茄子的产量和品质（张淑红 等，2009）。据记载，该病曾在欧洲、北美和亚洲的一些地区造成60%～80%的损失（宋敏丽，2006；李明远，2007），而国内随着蔬菜专业化生产和设施栽培的发展，茄子连作栽培越来越普遍，致使茄子黄萎病逐年加重，危害轻者减产30%～40%，重者绝收（Meyer et al.，1994；王茹华 等，2005；张淑红 等，2006a）。植物是生物活性物质的天然宝库，其产生的次生代谢产物超过40多万种，其中的一些化学物质具有杀虫、杀菌效果（Einhellig，1996）。自20世纪70年代以来，国内外很多学者在该领域，尤其是对病菌有抑制活性的植物提取物方面进行了很多有益的探索（Schutt & Netzly，1991；方哲 等，2008；尹晓东 等，2008；周宝利 等，2010）。Wilkins等报道有1389种植物有可能作为杀菌剂的原材料（Swain，1977）。张淑红等（2006b）研究了54种天然植物乙醇提取液对茄子黄萎病菌的抑菌活性，发现有15种植物提取物对茄子黄萎病菌菌丝生长抑制率大于50%。植物提取物，如：原白头翁〔Pulsatilla chinensis（Bunge）Rege〕提取液对小麦赤霉菌（Fusarium graminearumSchw.）菌丝有较强的抑制率（吴恭谦 等，1989），丁香〔Syzygium aromaticum（L.）Merr. Et Perry〕和细辛（Herbaasari）的提取物对番茄灰霉病菌有较强的抑制作用（王树桐 等，2003）。因此，本试验以茄子黄萎病为研究对象，用细辛提取物灌根处理茄子植株，研究其对茄子黄萎病的抗病防治效果、植株生长状况及抗性生理指标的影响，从而筛选出最佳的施用浓度，探讨利用细辛提取物抗黄萎病的可能性，为进一步开发植物源农药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试茄子品种为西安绿茄，由沈阳农业大学园艺学院提供。供试中药细辛购于沈阳农业大学医院。供试茄子黄萎病菌从沈阳农业大学植保学院获得，按照柯赫氏法则（Koch’s postulate）对其进行分离鉴定，在PDA培养基上25 ℃恒温继代培养。试验于2011年在沈阳农业大学蔬菜栽培生理与生态实验室和10号温室内进行。

1.2 材料提取和溶液制备

采用超声波提取法（UAE）（Willamson & Richardson，1988；张淑红 等，2006a），将细辛在阴处阴干，粉碎过40目筛（孔径0.37 mm）后与80%乙醇按1∶5（m∶V）的比例混合，在KQ2500DB型数控超声波清洗器中超声振荡提取30 min，离心（8000 r·min-1）20 min，取上清液，在室温下采用 EYELAN-1000型旋转蒸发真空仪浓缩，最后用 50%乙醇定容，药液毫升数与植物克数相等，得到的植物提取物母液浓度为1 g·mL-1，贮存于4 ℃冰箱备用。

1.3 田间预防试验

试验于 2011年在沈阳农业大学蔬菜基地日光温室内进行，2月 27日播种西安绿茄，3月27日分苗，定植于13 cm×12 cm的育苗钵中，栽培基质为营养基质∶草炭=3V∶1V，每钵1株，常规栽培管理。当幼苗长到四叶一心时，选取长势一致的幼苗，用浓度分别为1、2、4、8、10 g·L-1的细辛提取物进行灌根处理，每株50 mL，处理4次，每次间隔3 d，以浇灌相同体积的清水为对照。于最后一次处理后第 3天对植株采用伤根法接种黄萎病菌，孢子悬浮液的浓度为1×107个·L-1，每株接种50 mL。次日以相同方式重复接菌。于接菌后第4天开始调查发病情况，每隔5 d调查1次，连续调查5次，待对照发病较严重时，计算发病率、病情指数及防治效果。每处理20株，随机排列，3次重复。

1.4 田间治疗试验

当幼苗长到四叶一心时，选取长势一致的幼苗进行接菌，接菌方法和预防处理相同。接菌后第3天分别用不同浓度细辛提取物进行灌根处理，每株50 mL，处理4次，每次间隔3 d，以浇灌相同体积的清水为对照。于接菌后第4天开始调查发病情况，每隔5 d调查1次，连续调查5次，待对照发病较严重时，计算发病率、病情指数及防治效果。每处理 20株，随机排列，3次重复。

茄子黄萎病病情分级标准（张淑红 等，2009）：0级，无病株；1级，全株黄化萎蔫叶片少于1/4；2级，全株黄化萎蔫叶片占1/4～1/2；3级，全株黄化萎蔫叶片占1/2～3/4；4级，全株黄化萎蔫叶片达到3/4以上至全部萎蔫枯死。

式中：CK为空白对照病情指数；PT为细辛提取物处理病情指数。

1.5 细辛提取物处理对茄子根际土壤中黄萎病菌的田间抑制试验

通过对茄子植株发病率、病情指数及防治效果的调查，可以得出细辛提取物预防处理茄子幼苗的效果明显比治疗处理的效果好，因此后续的试验均以预防处理的茄子幼苗为研究对象。

当幼苗长到四叶一心时，选取长势一致的幼苗，用上述浓度的细辛提取物分别进行灌根处理，每株50 mL，处理4次，每次间隔3 d，以浇灌相同体积的清水为对照。于最后一次处理后第3天对植株采用伤根法接种黄萎病菌。于接菌后第4天开始检测根际土壤中黄萎病菌数量的变化，每5 d检测1次，连续检测4次，每处理20株，随机排列，3次重复。检测方法采用水筛法（周宝利 等，2012）：称取5 g土样，溶于装有200 mL水的三角瓶中，静置20 min后，充分摇动5 min，并在自来水下用38～200 μm筛网过筛，将留在38 μm筛网上的土壤残留物全部转移到小三角瓶中，用蒸馏水定容为40 mL。接5 皿，每皿用液移枪分别移取2 mL展布于培养基表面（每皿相对接种量为0.25 g），置于超净工作台上自然风干，25 ℃培养21 d，取出培养皿后在自来水下用毛刷轻轻刷掉培养基表面的土粒，在双目解剖镜下统计培养基上黄萎病菌微菌核萌发形成的菌落数。

1.6 生长指标测定

当幼苗长到四叶一心时，选取长势一致的幼苗，于接菌后第6天开始调查植株的生长状况。利用卷尺测定株高（茎基部到茎尖生长点的距离）；利用游标卡尺测量茎粗（子叶节上方约1 mm处茎的直径）；利用分析天平测定地上部、地下部鲜质量。

1.7 抗性生理指标测定

当幼苗长到四叶一心时，选取长势一致的幼苗，于接菌后第6天开始测定抗性生理指标。细胞膜相对透性（相对电导率）测定采用外渗电导法（郝建学和刘延吉，2001）；叶绿素含量测定采用丙酮和无水乙醇等体积比的混合浸提液黑暗浸提法（郝建军和刘延吉，2001）；根系活力测定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法（李合生，2002）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定采用苯丙氨酸脱氨显色法（张志安和陈展宇，2008）；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚染色法（刘萍和李明军，2007）；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用NBT染色法（郝建军和刘延吉，2001）。

1.8 数据处理

应用Microsoft Excel 2007和DPS软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 细辛提取物对茄子幼苗黄萎病发病率、病情指数及防治效果的影响

从表1可以看出，在预防处理和治疗处理中，1～10 g·L-1细辛提取物处理的茄子幼苗黄萎病发病率及病情指数均显著低于对照，表现出不同程度的抗病性，而且预防处理的发病率及病情指数都比治疗处理的低；其中4 g·L-1预防处理的茄子抗病性最强，发病率仅为14.24，病情指数为5.32，防治效果达到86.26%。

表1 细辛提取物对茄子幼苗黄萎病发病率、病情指数及防治效果的影响

2.2 细辛提取物对茄子幼苗根际土壤中黄萎病菌的抑制作用

从表 2可以看出，总体上，施加细辛提取物显著降低了茄子根际土壤中黄萎病菌的数量。随着植株的生长，施加细辛提取物处理的植株根际土壤中黄萎病菌数量在各个时期均明显低于对照，其中4 g·L-1处理的抑制作用优于其他处理浓度。在施加4 g·L-1细辛提取物时，茄子根际土壤中黄萎病菌的数量在各个时期与对照相比分别降低了 59.38%、62.79%、60.79%、60.06%。

表2 细辛提取物对茄子幼苗根际土壤中黄萎病菌的抑制作用

表3 细辛提取物对茄子幼苗生长的影响

表4 细辛提取物对茄子幼苗相对电导率、叶绿素含量、根系活力的影响

2.3 细辛提取物对茄子幼苗生长的影响

如表3所示，与对照相比，不同浓度细辛提取物处理的茄子幼苗株高、茎粗、地上部鲜质量、地下部鲜质量均表现出明显优势。随着细辛提取物浓度的增大，其对茄子幼苗各生长指标的优势作用呈先升高后降低的变化趋势。当细辛提取物浓度为4 g·L-1时，生长优势表现的最为明显，株高较对照增加了 10.35%，茎粗增加了 13.00%，地上部鲜质量增加了13.36%，地下部鲜质量增加了2.36%。除了浓度为1 g·L-1时地下部鲜质量与对照无显著差异外，其他各处理均显著高于对照。

2.4 细辛提取物对茄子幼苗抗性生理指标的影响

2.4.1 细辛提取物对茄子幼苗相对电导率、叶绿素含量、根系活力的影响 由表4可见，随着细辛提取物浓度的增加，茄子幼苗相对电导率表现出先降低再升高的变化趋势，与发病率呈正相关。当细辛提取物浓度为4 g·L-1时茄子幼苗相对电导率最低，为 13.03%，较对照降低 46.44%。各处理叶绿素含量、根系活力呈现出先升高再降低的趋势。当细辛提取物浓度为4 g·L-1时，茄子幼苗叶绿素含量最高，较对照提高了74.92%；根系活力最强，较对照提高了238.95%，且各处理与对照相比差异均达显著水平。

2.4.2 细辛提取物对茄子幼苗保护酶（PAL、POD、SOD）活性的影响 如表 5所示，与对照相比，不同浓度的细辛提取物处理均能极显著的提高茄子幼苗叶片PAL、POD、SOD的活性；随着细辛提取物浓度的增大，茄子幼苗叶片的PAL、POD和 SOD活性呈现先升高后降低的变化趋势，其峰值均出现在4 g·L-1时，较对照分别增加了295.57%、214.21%和53.92%；且各浓度处理的保护酶活性均极显著的高于对照。

表5 细辛提取物对茄子幼苗保护酶活性的影响

3 结论与讨论

众多研究表明，细辛具有抑制植物病原菌的活性。李少华（2011）在细辛对番茄早疫病菌的抑制作用及其活性成分的分离试验中得出，细辛对植物病原菌菌丝生长和孢子萌发均有不同程度的抑菌活性。张国珍等（1995）研究表明，细辛挥发油对Alternaria panax、Phytophthora cactorum、Rhizoctonia solani、Fusarium solani、Ustilago coicis等真菌的菌丝生长和孢子萌发具有一定的抑制作用。王树桐等（2004）在植物提取物对番茄灰霉病菌的抗菌活性室内筛选试验中，发现细辛提取物在很低浓度下对番茄灰霉病菌的菌丝生长和孢子萌发都具有极强的抑制作用。黄奔立等（2006）发现细辛浸提液对辣椒疫病菌、番茄灰霉病菌、茄黄萎病菌、黄瓜枯萎病菌和黄瓜菌核病菌有明显抑制作用。张淑红等（2006a）测定了天然植物提取物对茄子黄萎病菌的抑制活性，发现细辛提取物中存在抑制黄萎病菌的活性物质。

本试验结果也证明了细辛提取物对茄子黄萎病菌表现出很强的抑制作用。4 g·L-1细辛提取物预防处理对茄子黄萎病的防治效果最好，达到了86.26%，并且显著降低了根际土壤中黄萎病菌的数量。随着细辛提取物浓度的增加，茄子幼苗的株高和茎粗呈先增高再降低的变化趋势，且都显著高于对照，可见低浓度细辛提取物预防黄萎病发生的作用力强，从而抑制了由黄萎病对植株生长产生的不利影响，而高浓度的细辛提取物的抑制作用减弱。随着细辛提取物浓度的增加，茄子幼苗的相对电导率呈先降低再升高的变化趋势，与发病率呈正相关；当浓度为4 g·L-1时相对电导率最低，为 13.03%，较对照降低 46.44%。细辛提取物浓度在 0～4 g·L-1范围时，茄子幼苗的叶绿素含量及根系活力均随着浓度的增加而增加，浓度为 4 g·L-1时叶绿素含量最高，为1.569 mg·L-1，且根系活力也最强，达到了11.27 μg·L-1·min-1，较对照增强了238.95%；浓度为8、10 g·L-1时叶绿素含量及根系活力有所下降，但都极显著高于对照。这些均为细辛提取物增强茄子植株抗性、预防感病的重要体现。

近年来，细胞保护酶系统与植物抗病性的关系受到人们的普遍关注。孔庆科等（2001）对不同茄子品种接种黄萎病菌后的SOD、POD、PAL活性进行了测定，结果表明SOD、POD、PAL活性上升，而且抗病品种酶活性上升的较快。许多植物感病后，其体内保护酶活性的变化与植株抗病性呈正相关（张树生 等，2006）。本试验结果显示，不同浓度的细辛提取物均可提高茄子幼苗PAL、POD和SOD的活性，说明细辛提取物处理具有调节植株保护性酶系统平衡的功能，清除自由基功能增强，减小膜损伤程度，即防御酶活性增强，进而提高了茄子幼苗的抗病性；其中以4 g·L-1细辛提取物处理的茄子幼苗保护酶活性最高，PAL、POD和SOD的活性较对照分别提高了295.57%、214.21%和53.92%，抗病性最强，与田间抗病试验所得结果相同。

综上所述，细辛提取物处理抑制了茄子黄萎病的发生，降低了病情指数，促进了茄子植株的生长，提高了细胞保护酶的活性，从而增强了茄子植株的抗病性。随着细辛抑菌有效成分作用机理研究的逐步深入，人们对其认识和利用程度也必将上升到新的台阶。因此，以细辛作为植物病虫害有效的防治手段在无公害蔬菜生产中具有重要的意义和广阔的前景。

方哲，周如军，傅俊范，王帅．2008．64种药用植物提取液对 3种药用植物病原菌抑菌活性影响．沈阳农业大学学报，39（1）：24-27．

郝建军，刘延吉．2001．植物生理学实验技术．沈阳：辽宁科学技术出版社：162-166，175-180．

黄奔立，朱华，顾艳，许云东，沈明星，陆长婴．2006．中草药对5种蔬菜病菌的抑制作用．扬州大学学报，27（3）：84-86．

孔庆科，丁爱云，刘招舰，殷复伟．2001．茄子感染黄萎病菌前后酶活性的动态反应和同工酶变化．山东农业大学学报：自然科学版，32（3）：271-274．

李合生．2002．植物生理生化实验原理和技术．北京：高等教育出版社：141-142．

李明远．2007．茄子黄萎病的识别及防治．中国蔬菜，（6）：57-58．

李少华．2011．细辛对番茄早疫病菌的抑制作用及其活性成分的分离．中国农业大学学报，16（3）：67-71．

刘萍，李明军．2007．植物生理学实验技术．北京：科学出版社：123-125．

宋敏丽．2006．嫁接栽培对茄子黄萎病抗性及生长发育的影响．山西农业科学，34（3）：38-39．

王建平，胡伟，周桂乐，马小珍，彭素芳．2011．茄子黄萎病的发病规律及综合防治技术．中国果菜，（1）：29．

王茹华，周宝利，张启发，张凤丽，付亚文．2005．嫁接对茄子根际微生物种群数量的影响．园艺学报，32（1）：124-126．

王树桐，胡同乐，王晓燕，石丽君，张建茹，曹克强．2003．对番茄灰霉病菌有抗菌活性的植物提取物的室内筛选．河北农业大学学报，26（1）：61-64．

王树桐，曹克强，胡同乐，甄文超，付忠仿．2004．对番茄灰霉病菌有抑菌活性的丁香和细辛提取物提取条件研究．河北农业大学学报，27（1）：69-72．

吴恭谦，张超，伍越环．1989．三种毛茛科植物提取物及原白头翁素的活性研究．安徽农学院学报，（1）：21-31．

尹晓东，魏松红，刘冰，何智勇，白莹莹，胡莎．2008．大蒜提取液对番茄两种真菌病害的抑制作用．沈阳农业大学学报，39（1）：89-91．

张国珍，樊瑛，丁万隆，徐丽珍．1995．麻黄和细辛挥发油的抗真菌作用．植物保护学报，（4）：373-374．

张淑红，周宝利，张磊，付亚文．2006a．天然植物提取物对茄子黄萎病菌的抑制活性．应用生态学报，17（6）：1137-1140．

张淑红，周宝利，张磊，付亚文．2006b．不同提取条件对植物提取物抑制茄子黄萎病菌活性的影响．沈阳农业大学学报，37（4）：645-647．

张淑红，周宝利，张磊，郑玉艳．2009．苦参提取物对茄子黄萎病抗性及根际微生物的影响．沈阳农业大学学报，40（2）：215-217．张树生，胡蕾，刘忠良，方勇．2006．植物体内抗病相关酶与植物抗病性的关系．安徽农学通报，12（13）：48-49．

张志安，陈展宇．2008．植物生理学实验技术．长春：吉林大学出版社：202-203．

周宝利，陈丰，刘娜，吴琼，鲁博．2010．苯二甲酸二丁酯对茄子黄萎病及其幼苗生长的化感作用．西北农业学报，19（4）：179-183．周宝利，宋岩，李兴宝，李腾飞，孟茜．2012．蛇床子提取物对茄子根际土壤中黄萎菌数量及植株抗病性的影响．植物保护，38（3）：77-81．

Einhellig F A．1996．Interactions involving alleiopathic in cropping systems．Agron，88：886-893．

Meyer R，Slater V，Dubery I A．1994．A phytotoxic protein-lipopolysaccharide complex produced byVerticillium dahliae．Physiology，35（6）：1448-1454．

Schutt C，Netzly D．1991．Effect of apiforol and apigen-inidin on growth of selected fungi．J Chem Ecol，17：2261-2266．

Swain T．1977．Secnondary commpounds as proteetive agents．Ann Rev Plant Physiol，28：479-501．

Willamson G B，Richardson D．1988．Bioassays for allelopathy：measuring treatment responses with independent controls．J Chen Ecol，14（1）：181-187．