甘蓝SCR、THL与SRK交替相互作用的酵母双杂交检测

杨永军 张贺翠 杨 昆 薛丽琰 常登龙 朱利泉

（西南大学农学与生物科技学院植物生理生化实验室，重庆 400716）

植物的自交不亲和性（self-incompatibility，SI）是其为了避免自花受精而进化出的重要遗传机制。甘蓝（Brassica oleraceaL.）SI的分子过程是由存在于花粉中的S-位点富含半胱氨酸蛋白（S-locus cystein-rich protein，SCR），亦称为S位点蛋白11（S-locus protein11，SP11）识别结合柱头上的S受体激酶基因（Sreceptor kinase gene，SRK）启动，将原本结合于SRK上的负调控因子类硫氧还蛋白（thioredoxin-like protein，THL）释放出来，然后通过目前尚未完全知晓的分子过程实现自交不亲和性。SRK由S结构域（S域）、跨膜结构域以及激酶结构域3个结构域组成（Stein et al.，1991），SRK的胞外区域与SCR相识别，且基因序列与SLG具有较高的同源性（Takayama et al.，2001）；其本身又具有较高的多态性，与S位点紧密连锁，呈单倍型一致性。根据S-位点上SLG基因的结构，芸薹属自交不亲和复等位基因可分为两大类：class-Ⅰ自交不亲和复等位基因，SLG没有内含子；class-Ⅱ型S等位基因，SLG基因的3′末端附近有1个内含子（Hatakeyama et al.，1998a；Kusaba & Nishio，1999）。Ⅰ型和Ⅱ型的S基因的分化较早，差异较大（Kusaba et al.，1997），Ⅱ型不同物种的SLG基因之间同源性在86%以上，而Ⅰ型和Ⅱ型SLG基因之间同源性仅60%～70%。Nishio等（1996）根据这两类SLG基因序列特点设计特异引物，通过PCR扩增就能将这两类SLG基因区分开来。Stein等（1991）发现，在同一单倍型中S结构域中的SRK与SLG表现出极高的相似性，拥有很相似的单倍型和相似的S位点特异性，在序列上SLG可能与其他相似的SRK单倍型联系更加紧密。然而甘蓝S-2和S-6的单倍型数据显示，Ⅱ型与Ⅰ型序列差别很大（Kusaba et al.，1997）。研究还发现许多甘蓝类作物S等位基因兼有class-Ⅰ和class-Ⅱ型（Chen & Nasrallah，1990；Tantikanjana et al.，1993），在Ⅰ型和Ⅱ型兼有的植物中，所有Ⅱ型S复等位基因都属于花粉隐性表现型，包括B. rapa中的S-29、S-40、S-44和S-60单元型（Hatakeyama et al.，1998b；Takasaki et al.，2000）和B. oleracea中的S-2、S-5和S-15单元型（Chen & Nasrallah，1990；Scutt & Croy，1992；Cabrillaca et al.，1999），而大多数 class-Ⅰ型S复等位基因属于花粉显性表现型（Nasrallah et al.，1991）；研究发现Ⅰ型的SCR基因为显性基因，Ⅱ型的SCR基因为隐性基因，在转录过程中Ⅱ型的SCR基因的转录受到了抑制，因此植物表现显隐性的关系决定于S位点基因的转录情况（Shiba et al.，2002）。Ⅰ型和Ⅱ型S等位基因存在较高的保守区，同时也存在着较大的差异（Kusaba et al.，1997），这些差异涉及从授粉到受精过程中发生的花粉配体和雌蕊受体之间的相互作用以及相互作用的强弱关系（Kachroo et al.，2002；Ivanov et al.，2010）。S位点的基因结构不同而使Ⅰ型和Ⅱ型产生差异的分子机制尚不清楚，甘蓝两种类型的SRK与其下游的识别因子（SCR和THL1）之间的相互作用是否有区别，以及它们之间相互作用的强度又有什么关系还未见报道。因此建立一个适用于 class-Ⅱ型配体和受体之间，以及与其下游的THL1/THL2之间的蛋白质相互作用平台，进行蛋白质间相互作用机理的研究，对控制整个自交不亲和信号传导途径，以及确定class-Ⅰ和class-Ⅱ型自交不亲和程度具有重要意义。本试验拟构建class-Ⅱ型SCR2、eSRK2酵母双杂交表达载体和class-Ⅰ型SRKJ激酶域，THL1酵母双杂交表达载体，通过其毒性和自激活检测来确定自交不亲和性表型所依赖的3个起始信号传导元件之间识别程度的差异，进而通过激活酵母双杂交的报告基因所表达的多少来确定其相互作用程度。并通过生物信息学分析确定其Ⅰ型和Ⅱ型归属，以期能确定class-Ⅱ型内部的eSRK-SCR的互作及其与class-Ⅰ型之间THL、SCR与SRK存在的相互作用及其作用程度，为深入研究甘蓝自交不亲和性信号传导分子过程提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2011年7月～2012年1月在西南大学农学与生物科技学院植物生理生化实验室进行。甘蓝 B3、E1、D3是西南大学蔬菜学实验室选育的材料。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株为本实验室保存。EcoRⅠ、SmaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶，T4DNA连接酶购自 TaKaRa公司。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、DNA胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自TransGen公司。酵母双杂交系统（Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System）、x-α-gal、Aureobasidin A（以下简称AbA）及酵母培养基购自Clontech公司。DMSO购自Sigma公司。

1.2 SCR2、eSRK2、THL1的扩增

根据SCR2、eSRK2和THL1基因的结构特点，分别构建SCR2、eSRK2、THL1基因序列片段。依据GenBank中编号为AB067447的SP11-2序列和编码为AJ306585的SRK序列分析和酶切图谱，结合载体pGBKT7和pGADT7的多克隆位点，利用primer premier 6.0设计相应的RT-PCR引物。SCR2扩增的是第2个外显子。eSRK2正向引物从成熟肽第1个氨基酸开始，并去掉信号肽；反向引物是依据eSRK-3、eSRK-7、eSRK-15、eSRK-28、eSRK-6、eSRK-36、eSRK-18、eSRK-12、eSRK-60、eSRK-2设计的特异引物（表1）。另外，参照刘东等（2003）扩增的引物和条件，扩增THL1编码序列。SRK6（SRKJ）激酶域、eSRK28分别来自张贺翠等（2011）、杨红等（2011）。

以反转录的花药cDNA为模板扩增SCR2、eSRK2和THL1片段，eSRK2片段反应参数为94 ℃2 min；94 ℃ 2 min，55 ℃ 2 min，72 ℃ 45 s，30 个循环；72 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min 终止。以反转录的柱头cDNA为模板扩增eSRK2片段，反应参数为94 ℃ 2 min；94 ℃ 2 min，59 ℃ 60 s，30 个循环；72 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min 终止。THL1片段的反应参数为 94 ℃ 2 min；94 ℃ 2 min，52 ℃ 2 min，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min终止。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，以DNA胶回收试剂盒纯化回收。

表1 扩增SRK的S结构域和SCR的引物

1.3 酵母双杂交重组表达载体的构建

用EcoRⅠ和SmaⅠ对扩增产物SCR2、THL1和酵母表达质粒pGBKT7进行双酶切；用EcoRⅠ和BamHⅠ对eSRK2、SRKJ和酵母表达质粒pGADT7进行双酶切；SCR2、THL1片段与pGBKT7连接，转化E. coliDH5α感受态细胞，涂于LB平板上（含Kan+抗性）；eSRK2、SRKJ片段与pGADT7连接，转化E. coliDH5α感受态细胞，涂于LB平板上（含Amp+抗性）。37 ℃培养过夜，筛选阳性重组子，并进行菌液PCR和酶切鉴定，将含有插入目的片段的阳性克隆送北京华大基因研究中心测序。序列正确的重组质粒分别命名为pGBKT7-SCR2、pGBKT7-THL1、pGADT7-eSRK2和 pGADT7-SRKJ。

1.4 重组酵母双杂交表达质粒的毒性检测

根据酵母双杂交系统使用说明书（Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual），采用LiAc法制备感受态酵母菌Y2HGold和Y187。用PEG/LiAc法将pGBKT7空载和重组诱饵载体pGBKT7-SCR2、pGBKT7-THL1同时转化 Y2HGold酵母感受态细胞，30 ℃培养 3～5 d，观察其在SD/-Trp筛选平板上的生长情况。采用同样的方法将pGADT7空载和重组AD质粒pGADT7-eSRK2、pGADT7-SRKJ转化Y187感受态细胞，观察其在SD/-Leu平板上的生长情况。

1.5 重组诱饵载体的自激活检测

用PEG/LiAc法将pGBKT7-SCR2转化Y2HGold酵母感受态细胞，分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/xα-gal、SD/-Trp/x-α-gal/AbA平板上；将 pGADT7-eSRK2转化 Y187感受态细胞，分别涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/x-α-gal平板上，30 ℃倒置培养 3～5 d，观察 pGBKT7-SCR2、pGBKT7-THL1在选择平板上的生长情况。以 pGBKT7-Lam×pGADT7-T为阴性对照，以 pGBKT7-p53×pGADT7-T为阳性对照。

1.6 SRKJ与 THL1、SCR2与 eSRK2、eSRK28与 SCR2、eSRK28与 SCR28相互作用检测

分别挑取SD/-Trp、SD/-Leu平板上的菌落，将含有SCR2和eSRK2片段的pGBKT7-SCR2×pGADT7-eSRK2转化菌落组合，同时接种于500 μL的2×YPDA液体培养基中，30 ℃振荡培养18～20 h，在显微镜下检测 Y2HGold与 Y187交配形成二倍体接合型的情况。以 pGBKT7-Lam×pGADT7-T为阴性对照，以 pGBKT7-p53×pGADT7-T为阳性对照。然后将融合菌液涂布到SD/-Trp-Leu（DDO）、SD/-Trp-Leu/x-α-gal/AbA（DDO/x/A）平板上，30 ℃培养3～5 d。最后将DDO/x/A平板上的蓝色克隆划线至SD/-His-Trp-Leu（TDO）、SD/-His-Trp-Leu/x-α-gal/AbA（TDO/x/A）和 SD/-Trp-Leu-Ade（TDO）、SD/-Trp-Leu-ura/x-α-gal/AbA（TDO/x/A）和SD/-Trp-Leu-Ade-His/x-α-gal/AbA（QDO/x/A）平板，观察其生长情况。

采用同样的方法检测 eSRK2×THL1、eSRK28×SCR2、SRKJ×THL1、eSRK28×SCR28在 DDO、DDO/x/A平板上的生长情况；然后将DDO/x/A平板上的蓝色克隆划线至TDO、TDO/x/A或TDO、TDO/x/A和QDO/x/A平板，观察其生长情况。

2 结果与分析

2.1 class-Ⅰ型的SCR、eSRK和class-Ⅱ型的SCR、eSRK的基因克隆及序列分析

扩增的eSRK2位于第1个外显子的74～1321 bp之间，编码了416个氨基酸。应用Vector NTI Advance分析Ⅰ型和Ⅱ型的SRK氨基酸序列（图1），发现其序列相似性在48.6%～84.2%之间，class-Ⅱ型的 eSRK之间的蛋白序列相似性要高于 class-Ⅰ型。class-Ⅱ型中的S-2、S-5和S-15之间的序列相似性达到93.0%～97.3%；class-Ⅰ型的单倍型S-1、S-7、S-8、S-14、S-11、S-24和S-29之间蛋白质序列比classⅡ型的序列相似性低。由此推断，蛋白序列的不同是造成自交不亲和性的主要原因之一。比对结果还发现，Ⅰ型和Ⅱ型的氨基酸序列在219～330 bp的氨基酸区间和446～460 bp的氨基酸区间呈现较大的差异，class-Ⅰ型的氨基酸存在部分缺失。

图1 甘蓝class-Ⅰ型和class-Ⅱ型eSRK氨基酸序列比对分析结果

本试验扩增的是SCR2的第2个外显子，共编码65个氨基酸。应用Vector NTI Advance分析SCR氨基酸序列（图 2）。class-Ⅰ型中不同单倍型 SCR氨基酸的相似度为 20%～76%；class-Ⅱ型中不同单倍型SCR蛋白质序列两两之间的相似度达到63%～94%。class-Ⅰ型SCR的4个半胱氨酸残基高度保守，另外4个半胱氨酸残基所处的位置略有差异；而class-Ⅱ型SCR的8个半胱氨酸残基高度保守。Ⅰ型的SCR、eSRK和Ⅱ型的SCR、eSRK在蛋白质序列上存在差异，进而导致了自交不亲和蛋白结构和功能的差异，表现为不同的自交不亲和强度。

eSRK2、SCR2及THL1的 PCR扩增产物分别约为 1200 bp（图 3）、200 bp（图 4）和 400 bp（图5）。经纯化和测序后得出，eSRK2、SCR2和THL1的序列长度分别为195、1248、430 bp，与电泳结果一致。序列分析发现，SCR2与SCR（GB|AB067447|）的序列完全一致；eSRK2与eSRK2D（GB|AJ306585|）的序列完全一致；THL1与刘东等（2003）的序列完全一致。

图2 甘蓝class-I型和class-Ⅱ型SCR氨基酸序列比对分析结果

图3 eSRK2基因PCR扩增结果

2.2 重组质粒 pGADT7-eSRK2、pGBKT7-SCR2、pGADT7-SRKJ 和 pGBKT7-THL1的构建及酶切鉴定

提取筛选的阳性克隆质粒DNA并进行双酶切鉴定，电泳检测得到与eSRK2、SCR2、SRKJ、THL1大小一致的片段（图 6），表明载体构建成功。DNA测序结果分析表明，pGBKT7-eSRK2载体中包含的eSRK2片段序列、插入位点和读框正确，且插入的eSRK2片段序列与目的序列完全一致。pGBKT7-SCR2载体中包含的SCR2片段序列、插入位点和读码框正确，且插入的SCR2片段序列与SCR2（SP11-2）序列完全一致。pGADT7-SRKJ和pGBKT7-THL1载体中包含的SRKJ和THL1片段序列、插入位点和读码框正确，且插入的SRKJ和THL1片段序列与SRKJ和THL1序列完全一致。

图4 SCR2基因PCR扩增结果

图5 THL2基因PCR扩增结果M，Trans2K PlusⅡDNA marker；1，THL1。

图6 pGBKT7-eSRK2的EcoRⅠ和SmaⅠ双酶切，pGBKT7-SCR2、pGADT7-SRKJ和pGBKT7-THL1的EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切图谱

2.3 诱饵蛋白毒性及其自激活检测分析和pGBKT7-SRK毒性检测分析

将 pGBKT7-SCR2质粒、pGBKT7-THL1质粒、空载对照pGBKT7质粒用LiAc法转化酵母双杂交报告菌株Y2HGold中，而后接种于SD/-Trp、SD/-Trp/x-a-gal、SD/-Trp/x-α-gal/AbA平板培养基上，30 ℃培养3 d。pGBKT7-SCR2质粒在SD/-Trp（未附图）和SD/-Trp/x-a-gal（图7-c-2）平板上产生白色菌落；pGBKT7-THL1质粒在SD/-Trp（未附图）和SD/-Trp/x-a-gal（图7-d-2）平板上出现了生长状态良好、菌斑与空载pGBKT7（图7-c-1）大小相近、菌斑密度均无明显差异的白色克隆，证明转入的表达蛋白对酵母无毒害作用。经酵母菌落 PCR鉴定，证明诱饵载体pGBKT7-SCR2、pGBKT7-THL1已经成功转化到酵母中。pGBKT7-SCR2和 pGBKT7-THL1在 SD/-Trp/x-α-gal/AbA平板上没有菌落生长（未附图）。阳性对照 pGBKT7-p53×pGADT7-T有明显的蓝色克隆子出现，而阴性对照pGBKT7-Lam×pGADT7-T无克隆子出现（图7-b）。表明含有pGBKT7-SCR2和pGBKT7-THL1质粒的酵母细胞没有激活报告基因AUR1-C和MEL1，没有发生自身的转录激活作用。

图7 重组质粒pGBKT7-SCR2自激活作用和毒性检测及诱饵质粒pGADT7-eSRK2的毒性检测结果

将pGADT7空载、pGADT7-SRKJ和pGADT7-eSRK2转化Y187，观察到它们都能在SD/-Leu平板上良好的生长。pGADT7-SRKJ（图7-d-1）和pGADT7-eSRK2（图7-a-2）在SD/-Leu平板上生长状态良好。而且其对照 pGADT7（图 7-a-1）斑点大小及生长时间与 pGADT7-eSRK2和pGADT7-SRKJ一致，说明表达蛋白对酵母菌无毒害作用。经酵母菌落 PCR鉴定，证明诱饵载体pGADT7-eSRK2和pGADT7-SRKJ已经成功转化到酵母中。

2.4 SCR2与 eSRK2、eSRK28与 SCR2、SRKJ 与 THL1相互作用检测

将 3 个组合 Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL1〕、Y2HGold〔pGBKT7- SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK2〕、Y2HGold〔pGBKT7-SCR28〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕和 Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕都转到DDO平板上，均能出现生长状态良好的菌斑，表明双杂交重组表达质粒成功转入二倍体接合型酵母菌中。同时用 3个组合中片段相应的引物组合对 DDO平板上的菌落进行酵母菌液 PCR检测，结果发现同一单菌落有明显的SCR2和eSRK2、SRKJ和THL1目的片段；Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕未检测出目的片段，进一步验证了重组质粒 pGBKT7-SCR2×pGADT7-eSRK2、pGADT7-SRKJ×pGBKT7-THL1成功转入二倍体接合型酵母菌中。组合 Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL1〕和Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK2〕都能在DDO/x/A平板上长出明显的蓝色菌落（表2），表明这2个组合激活了报告基因AUR1-C和MEL1；Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕在DDO/x/A平板上未长出蓝色菌落，初步判断没有相互作用。为更进一步检测相互作用的可能性，排除假阳性和假阴性的出现，将 DDO/x/A平板上的蓝色克隆划线至TDO/x/A和QDO/x/A平板上，4 d后发现涂有Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK2〕的TDO/x/A在平板上呈蓝色，而QDO/x/A平板上酵母菌株没有生长的迹象，表明报告基因HIS3也能被激活，而报告基因ADE未激活（图8）。Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL1〕和 Y2HGold〔pGBKT7-SCR28〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕在 TDO/x/A和 QDO/x/A平板上都呈蓝色，表明报告基因HIS3和ADE被激活。Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕的融合株在三缺平板和四缺平板上都没有生长，证明了不同单倍型之间没有相互作用。

表2 酵母中SCR2与eSRK2、eSRK28与SCR2、SRKJ与THL1相互作用的检测结果

续 表

与杨红等（2011）对于class-Ⅰ型的研究结果进行对比分析（表 3），更加系统的说明了自交不亲和Ⅰ型和Ⅱ型不同的相互作用关系，即酵母中报告基因表达的数目和类型的差异反映了class-Ⅱ内部的SCR-SRK和class-Ⅰ型的SCR-SRK的互作强度，Ⅰ型高于Ⅱ型；THL与SRK之间存在较高的互作强度。

图8 酵母融合株在QDO/x/A和TDO/x/A平板上相互作用检测结果

表3 酵母双杂交中class-Ⅰ型和class-Ⅱ型不同的相互作用关系

3 结论与讨论

酵母的基因组中有一种特殊的上游激活序列（upstream activating sequence，UAS），在转录水平调控基因AUR1-C、HIS3、ADE2、lacZ和MEL1表达，它与激活蛋白结合大大增加了下游基因的转录速度。GAL4为酵母UAS的结合蛋白，它的正常结合可以激活UAS下游基因的转录。GAL4有两个结构域，即N端的DNA结合结构域（DNA binding domain，BD）和C端的转录激活结构域（transcriptional activating domain，AD）。GAL4蛋白的两个结合域分开时不能激活UAS下游基因的转录，只有将这两部分通过适当的途径连在一起后才能恢复激活转录的活性。如果BD连上1个诱饵蛋白（bait），AD上接1个猎物蛋白（prey），当诱饵蛋白和猎物蛋白发生互作，则BD和AD因距离靠近或结合在一起形成的完整的GAL4蛋白，激活下游报道基因的表达。在酵母菌 Y2HGold中受 3个不同的启动子作用，通过不同的操纵基因调节 4个完整的报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2和MEL1，酵母菌Y187中有2个报告基因MEL1和lacZ；诱饵蛋白和猎物蛋白的互作强度与整个基因之间的相互作用强度存在必然的联系。根据酵母双杂交系统可以提出假设：由于诱饵蛋白和猎物蛋白的相互作用强度差异，使下游启动子对报告基因启动的数目不同，再由酵母双杂交试验得出结果，从而探讨class-Ⅰ型和class-Ⅱ型以及与THL1自交不亲和程度关系。结果显示，class-Ⅱ型中能够激活的报告基因要比 class-Ⅰ型要少，证明了 3个启动子存在不同的启动强度，激活不同数目的报告基因。

甘蓝中存在自交不亲和机制，根据S位点的基因结构不同可以将其分为两类，class-Ⅰ型和class-Ⅱ型，然而它们产生差异的分子机制尚不清楚。有研究表明，SCR与 SRK胞外结构域之间的亲和力很高（Shimosato et al.，2007），SLG仅通过与SRK胞外S结构域聚集而起辅助受体的作用（Cui et al.，2000；Takasaki et al.，2000；Silva et al.，2001）来进一步提高这种亲和力，因此SRK与SCR之间的识别速度和结合强度与自交不亲和性的强弱类型直接成正相关，当SRK与SCR之间识别快而强时，表现为Ⅰ类自交不亲和性的诸多亚类型；当SRK与SCR之间识别慢而弱时，表现为Ⅱ类自交不亲和性的诸多亚类型。Bower等（1996）利用酵母双杂交技术从甘蓝柱头cDNA文库筛选出SRK下游因子类硫氧还蛋白1/2（THL1/THL2）。Ivanov等（2010）研究证明了SRK是自交不亲和信号传导的核心因子，负责将细胞外信号传递到细胞内。Kachroo等（2002）和Ivanov等（2010）提出自交不亲和的信号通路是：在甘蓝开花时期THL1/THL2与SRK激酶结构域相结合，从而抑制其激酶活性，当花粉落到柱头上后，相同单倍型SCR与SRK胞外结构域结合，致使 SRK构象变化，使其释放原本结合在激酶结构域的THL1/THL2，激活SRK激酶域活性，进而在细胞内引发次级级联反应，继续传递来自细胞外的信号，并最终导致自交不亲和反应的发生。这样自交不亲和反应中的SCR、THL与SRK之间就存在一个交替互作的关系，也为本试验利用酵母双杂交技术探讨两类SRK之间的SCR-SRK-THL的交替相互作用的关系奠定了基础。

S单倍型之间的S基因的高度多态性是芸薹属自交不亲和性以多种类型存在的分子原因（Castric & Vekemans，2007；Edh et al.，2008）。Edh等（2009）将 class-Ⅱ型的S单倍型与class-Ⅰ型的S单倍型的SP11、SLG和SRK的核苷酸序列进行比较分析，发现class-Ⅱ型的序列更加保守；对class-Ⅱ型的S-60单倍型的研究发现，class-Ⅱ型的S-60单倍型与class-Ⅰ型截然不同，而且在S-60中SCR、SRK和SLG的位置与class-Ⅰ型的S-910完全不相同。经氨基酸序列比较分析，发现 class-Ⅱ型的氨基酸多样化程度明显要比 class-Ⅰ型小得多。class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的SCR、SLG和SRK序列上的差异导致了class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的不同，这些不同有助于有效地抑制两者和不同的S单倍型之间的重组。Kristina等（2009）分析S结构域的进化起源时，根据甘蓝的优势地位，利用系统进化树分析SRK激酶结构域得到一个紧密的关系，并将其分成了class-Ⅰa型、class-Ⅰb型和class-Ⅱ型，这个结论重新定义了class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的关系。在关于class-Ⅰ型的研究中class-Ⅰb型的单体型占有的主导优势要低一些，它处在class-Ⅰa单体型和class-Ⅱ单体型之间。经过不断的试验和总结，Billiard等（2007）定义了一个优势等级，提出这样一个理论模型：认为在柱头共显性和在花粉中的优势序位是class-Ⅰa＞class-Ⅰb＞class-Ⅱ。自交不亲和越强就意味着它能够更有力的阻止自身的花粉与柱头受精、预防近亲繁殖和促进远系杂交，保持遗传多样性，笔者利用酵母双杂交试验证明了两类相互作用的程度不同，验证了上面提出的理论优势序位，证实了相互作用的程度class-Ⅰ型＞class-Ⅱ型。

SRK作为柱头S基因，与SCR识别的胞外S结构域编码区变异性较大（Takayama et al.，2001），两者之间的这种较大的变异性，在进化上赋予了S单倍型的多态性；而负责同下游功能蛋白作用的C-端激酶结构域的编码区变异性却较小，说明在进化上赋予了其下游功能蛋白所决定的是一个目前尚未完全知晓的共同信号传导过程（Samuel et al.，2008）。张贺翠等（2011）扩增了不同亚种的ARC1基因，利用酵母双杂交证明都能与SRK激酶域发生互作，也证明了SRK的C-端激酶结构域是一个高度保守的区域。本试验中利用酵母双杂交技术证明了组合SRKJ与THL1在四缺平板（QDO/x/A）上能够生长，存在相互作用，并激活了全部的 4个报告基因，由于C-端激酶结构域的编码区变异性较小甚至不存在什么变化，所以SRK2激酶域也能够和THL1相互作用，激活了全部的4个报告基因。另外，Luo等（2011）以甘蓝材料D3、B3、E1、A1、H1、230、240、243、N1、G1的柱头和花粉cDNA为模板，扩增了甘蓝的SRK胞外域序列（eSRK3），利用酵母双杂交技术证明了D3材料中的eSRK与SCR蛋白之间以及E1材料中的eSRK与SCR蛋白之间能够相互结合，但E1材料中的eSRK与D3材料中的SCR蛋白之间以及D3材料中的eSRK与E1材料中的SCR蛋白之间不相互结合，为深入研究eSRK-SCR作用位点建立了一个技术平台，也证明了class-Ⅰ型S-3中的SRK和SCR存在相互作用。杨红等（2011）和本试验利用酵母双杂交技术证明了S-28中的SCR与eSRK存在相互作用，且其相互作用区域位于SCR28（GenBank AB190356）的 1876～2052 bp、eSRK28（GenBank AB190356）的 418～1276 bp 区域。同时，也指出了SRK跨膜域的存在与否对SCR与SRK相互作用没有影响；SCR-SRK复合体的S单倍型特异性导致了SI反应的特异性。这充分说明利用酵母双杂交技术可以证明class-Ⅰ型自交不亲和复等位基因的SCR和eSRK存在相互作用，而class-Ⅱ型S等位基因是否也存在同样的相互作用，以及class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的相互作用程度关系，却并不了解。

本试验选择了一个新的思路，将SCR-SRK-THL之间存在的相互作用做了一个纵向的研究，以试验中出现的激活不同报告基因的个数来提出假设，以试验结果推断 class-Ⅰ型和 class-Ⅱ型的相互作用程度关系，利用酵母双杂交技术初步确定 PGBKT7-SCR2×pGADT7-eSRK2之间存在相互作用，说明class-Ⅱ型自交不亲和复等位基因激活了编码AUR1-C、MEL1和HIS3报告基因，却未激活编码ADE2报告基因。由于激酶域的高度相似性，认为class-Ⅱ型SRK2激酶域与THL1之间的相互作用也可以激活 4个报告基因。对照 pGBKT7-SCR2×pGADT7-eSRK28的融合株在TDO/x/A平板上不能生长，说明不同单倍型中的SCR与eSRK并不存在相互作用。再结合杨红等（2011）对于class-I型的相互作用的研究结果，以class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的相互作用激活3个起始信号传导元件，而它们之间的识别程度差异表现为不同数量、种类的报告基因，使其在不同的氨基酸缺陷平板上生长，分析 class-Ⅰ型和 class-Ⅱ型与 THL1的相互作用关系。结果表明Ⅰ型的SCR-eSRK激活了4个报告基因；Ⅱ型的SCR-eSRK由于启动子的启动强度较Ⅰ型弱，激活了3个报告基因；由于S位点激酶域的高度保守性，两类SRK（激酶域）的变异性较小，所以SRK（激酶域）-THL1都能激活4个报告基因，利用酵母双杂交试验检测了甘蓝SCR、THL和SRK之间交替相互作用的关系。这一结果也证明了酵母双杂交系统对于class-Ⅱ型自交不亲和复等位基因的相互作用检测同样适用，这样也从一个侧面进一步完善了酵母双杂交系统。

class-Ⅰ型的SCR-eSRK和SRK激酶域与THL1之间的相互作用激活了4个报告基因，即编码AUR1-C、MEL1、ADE2、HIS3的基因，class-Ⅱ型的SCR-eSRK之间的相互作用由于诱饵载体与猎物载体蛋白的结合能力不同，使得激活3个启动子的能力不同，激活了3个报告基因，即编码AUR1-C、MEL1、HIS3的基因，ADE2的基因未激活。class-Ⅱ型 SRK2激酶域与 THL1之间的相互作用也可以激活4个报告基因。class-Ⅰ型之间和class-Ⅱ型之间不存在相互作用。初步认为，class-Ⅰ型的自交不亲和性强于class-Ⅱ型；利用酵母双杂交技术同样可以鉴定class-Ⅱ型之间存在的相互作用，Ⅰ型强于Ⅱ型，甘蓝 SCR-SRK-THL存在一个 SCR-SRK、SRK-THL交替相互作用的关系。

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