猪细小病毒病诊断技术研究进展

刘 建，汤德元*，罗险峰，李春燕，甘振磊，王 凤，郝 飞

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

猪细小病毒病是由猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)引起的母猪繁殖障碍疾病之一，该病的主要特征为感染母猪，特别是感染初产母猪后导致流产、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及带病弱仔猪等，同时，PPV还与非化脓性心肌炎、皮炎、肠炎及病毒血症等有关[1]。猪细小病毒是Mary和Mahnel于1966年在用猪肾原代细胞进行猪瘟病毒组织培养时发现的，随后被鉴定为一种DNA病毒。Cartwight等[2]首次证实了其致病性。自20世纪60年代中期以来，欧洲、美洲、亚洲等很多国家分离到该病毒或检测出其抗体。国内潘雪珠等（1982）在上海首次分离到该病毒，此后在全国不同省份均有分离到PPV的报道。由于妊娠母猪感染该病毒后临床症状不明显，而且该病毒对理化因素的抵抗力很强，造成该病在世界范围内广泛传播和流行，给世界养猪业造成严重的经济损失，因此受到了高度重视，国内外对该病毒的研究也逐渐深入。

当前，对PPV的快速检测是有效控制和消灭该病的前提。猪细小病毒感染可依据临床症状和流行病学做出初步诊断，—般认为，如果仅妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、胎儿发育异常等状况而母猪本身无明显症状，同时有证据表明是传染性疾病时，则应考虑到PPV感染的可能。但是本病与猪伪狂犬病、猪乙型脑炎和猪布鲁氏菌病的临诊症状非常相似。因此，确诊必须进行实验室诊断。目前已建立了许多PPV检测及诊断方法，现将研究结果综述如下。

1 临床诊断

母猪在不同的怀孕期感染PPV后的症状不同。在怀孕30～50 d之间感染时，主要是产木乃伊胎；怀孕50～60 d之间感染时，主要是出现死胎；怀孕70 d左右感染时，主要是出现流产症状；在怀孕70 d后，大多数胎儿由于对病毒感染产生免疫反应而存活，但体内常带有抗体和病毒。对病死猪的解剖可见其主要病变是母猪有轻度子宫内膜炎，胎盘部分钙化；大多数死胎、死仔或弱仔皮肤和皮下可见充血或水肿，胸腔、腹腔积有淡红或淡黄色渗出液，肝、肺、肾有时肿大脆弱或萎缩发暗，个别死胎皮肤出血，弱仔生后10 h先在耳尖，后在颈、胸、腹部及四肢末端内侧出现淤血、出血斑，半日内皮肤全部变紫而死亡。若仅仅依靠这些临床表现很难与其他导致流产性疫病的感染，如猪伪狂犬病、猪乙型脑炎和猪布鲁氏菌病等相区别。因此，确诊必须进行实验室诊断。

2 病原学诊断

从流产母猪的子宫分泌物或者流产胎儿的肾、肺、睾丸、脑、胎盘和肠系膜淋巴结等样品中检测出有PPV就可以做出阳性诊断。

2.1 病毒的分离鉴定

病毒的分离多采用接种细胞的方法。PPV只能在来源于猪的细胞(如猪肾原代细胞、猪睾丸细胞，次代猪肾、猪睾丸细胞及PK-15，CPK，IBRS-2，MVPK，ST等传代细胞)和人的某些传代细胞(如Hela，KB，Hep-2，Lul32等细胞)中培养增殖，其中以猪肾原代细胞较为常用。由于PPV复制需要细胞源DNA合成酶，最适宜在具有旺盛增殖能力并处于有丝分裂过程中的细胞内增殖，因此进行PPV培养时应与细胞同时接种或在细胞未形成单层之前接种，这是PPV分离成功与否的关键。

在进行PPV分离时通常采取流产胎儿的肾、肺、睾丸、脑、胎盘和肠系膜淋巴结等病料分离病毒，其中以肠系膜淋巴结和肝脏的病毒分离率最高。病料按参考文献[3]剪碎处理后，用PBS制成1∶10的悬液，加入双抗后研磨，反复冻融2次，然后超声波裂解3 min，并经2 000 r/min离心后，取上清液与培养细胞同步接种或者接种于尚未长成单层的猪肾原代细胞。37 ℃培养，逐日观察细胞病变（CPE）。接种了样品的细胞于48～96 h后可明显见到规律性的CPE：细胞浆出现弥散性颗粒，病变细胞变圆，聚集成簇，呈现拉网状，96～120 h后，这种灶性细胞病变由疏散状态发展为密布整个培养瓶；144 h以后，病变的细胞逐渐脱落、上浮。待细胞出现明显病变后，收获冻存。同时设不接种病料的细胞作为对照。如5～6 d后还未出现病变，再盲传3代，若无病变则弃之。凡是出现CPE的样品判为阳性，无CPE的为阴性。

2.2 电镜检查

—般来讲，电镜法可对病原的检出做出准确诊断，通过电镜可以观察病毒的结构、形态特征及立体构型等特点。光学显微镜仅限于对病毒包涵体的检查(病毒细胞培养物核内包涵体—般在接种后16～36 h出现)，但阳性检出率不高。电镜和免疫电镜技术可观察到感染细胞超微结构的改变，可准确定位细胞内的病毒粒子。A M Field等取流产的水肿胎儿组织作为标本进行电镜观察(新鲜标本用免疫电镜观察；福尔马林固定标本直接用透射电镜观察)，结果显示病毒颗粒存在于受感染细胞的核内及胞浆内，而且新鲜标本比福尔马林固定标本敏感性高。

3 血清学诊断

3.1 血凝试验(HA)

在96微孔板中进行，自左至右每孔中预先加入50μL生理盐水（或者PBS溶液），然后取病毒原液或者收获液（将出现病变的细胞培养物反复冻融3次，2 000 r/min离心10 min，除去细胞碎片，收获病毒液）。自左至右按1∶2、1∶4、l∶2n作倍比稀释，每孔加入50μL，最后—孔设为对照。然后每孔再加入50μL的0.5%豚鼠红细胞(或者1%鸡红细胞)，在微型振荡混合器上振荡1 min混匀后，置37 ℃温箱中作用15～30 min，判定结果，以50%的红细胞能发生凝集判为终点，样品出现凝集终点的最高稀释度定为HA滴度。该方法操作简便，且能进行快速、大量的诊断，但灵敏度低、特异性不强，因此只能作为辅助诊断方法。

3.2 血凝抑制试验

血凝抑制试验(HI)是基层兽医检测PPV较为常用的方法。取发病仔猪组织浸出液制备成血凝素，并稀释成8个血凝单位。取患病初产母猪血清1 mL，注入试管中，后再向试管中加入8个凝集单位的血凝集1 mL，摇匀，然后再向试管中加入1%的鸡血细胞，置37 ℃恒温培养箱中30 min，观察试管中有无凝集现象。以100%抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的滴度，即血清效价。凡是被PPV阳性血清抑制血凝者，该病毒即为PPV。利用HI检测人工感染PPV的猪，发现感染后5 d即可以检测到阳性抗体，12～14 d抗体滴度高达1 024～4 096，并能持续多年检出抗体。待检血清进行HI试验时需要先进行灭活处理，然后再用红细胞吸附，以除去血清中的非特异性血凝素，进—步用高岭土吸附以除去或减少血清中非特异性抑制因子。李刚明等应用该方法对湖北省7个地区62个猪场的1 086份血清进行检测，结果检出PPV阳性血清726份，阳性率66.85%。除一个山区猪场未查出阳性猪外，其余61个猪场均不同程度地检查出PPV阳性抗体，有个别猪场检出的抗体阳性率甚至达到了100%。目前，该方法在国内外已广泛应用。

3.3 血清中和试验

血清中和试验(SN)是最经典、传统的血清学方法，用于检测中和抗体。其原理是利用被检血清的抗体中和PPV，然后根据培养细胞的病变情况来计算血清抗体的滴度。JooHS等[3]建立了SN的标准方法，即采用血清稀释法，同时设已知阴、阳性血清对照。向经过灭活的不同稀释度的血清管中加入等量的滴度为100 TCID50/0.1 mL的病毒悬液，混匀后放置2 h，取0.2 mL分别加入3～4支SK细胞系或猪肾继代细胞的培养管中，在轻度震荡下吸附1 h，然后补足维持液，静止或旋转培养5～10 d判定结果。虽然SN的特异性比HI高，但操作复杂，首先要进行病毒感染力的测定，而PPV在低剂量时并不引起细胞病变，因此限制了该方法的使用。

3.4 乳胶凝集试验

何启盖[4]等将灭活的PPV经硫酸铵沉淀、透析浓缩后病毒液致敏乳胶建立了该方法，可用来检测PPV抗体。乳胶凝集试验(LAT)主要操作如下，将PPV接种IBRS-2细胞培养增殖，待出现细胞病变（CPE）后，反复冻融细胞，收集病毒液，然后用甲醛灭活，再用硫酸铵沉淀，透析浓缩。将浓缩的PPV进行方阵滴定，选择致敏乳胶的最佳条件，制成细小病毒LAT抗原。将该抗原与PPV阳性血清反应，可观察到凝集颗粒，而该抗原与生理盐水、PBS、猪瘟、猪弓形体病、猪衣原体病、伪狂犬病、口蹄疫等阳性血清反应无任何现象，因此可用本法诊断PPV。杨均等用该方法对贵州省4个地区6个已经免疫PPV的规模化猪场进行PPV抗体水平检测，结果显示，PPV免疫抗体水平阳性率为77.9%。邓位喜等运用该方法对遵义地区 7个县(市)部分规模养殖场和散养户随机采取271份猪血清进行了血清学检测，结果显示该地区规模化养殖场和散养户的细小病毒病抗体阳性检出率分别是5.21%(11/211)和3.33%( 2/60)，且个别县阳性率达27.59% (8/29) 。

由于该方法具有简便、快速、经济等特点，被称为“傻瓜技术”，特别适合于临床上的现场检测。应用该方法检测早期的PPV抗体非常有效，因为猪感染PPV后，IgM出现最早，而乳胶可以和 IgM发生很好的反应。

3.5 荧光抗体染色法

该方法可直接镜检组织冰冻切片。采取可疑病猪的扁桃体或者母猪产出的死胎、木乃伊胎，然后将各种组织做冰冻切片，用荧光抗体诊断液染色待检PPV标本片，将染色标本片置湿盒中，放入37 ℃培养箱作用30 min。取出用PBS液(pH值7.2～7.6)冲洗和漂洗15 min(中间换液1次)，再用去离子水冲洗除盐，放置标本片让其自然干燥，然后滴加磷酸甘油，盖上洁净的盖玻片，放于荧光显微镜下观察。若发现细胞内有亮绿色荧光颗粒集结，而对照无现象，则可判定有PPV抗原。此外，该方法也可以快速准确的检测出病毒抗原，还可以在病毒培养过程中，对接种病毒的单层细胞进行检查。荧光抗体染色法较HI敏感度高，是—种特异性强、检出率高且快速的诊断方法。

3.6 间接免疫荧光技术

早在1970年Cartwright等就用荧光显微镜来检测细胞培养物中是否分离到了PPV。董齐等[5]建立了间接免疫荧光诊断技术以检测猪细小病毒抗原。该方法是将猪细小病毒高免血清和猪胎儿组织中的PPV抗原形成特异性的反应，再加兔抗猪IgG荧光抗体，扩大抗原抗体反应的范围来提高检出率。应用该技术，对PPV人工感染猪和母猪流产、死胎的猪胎儿，采集其肝、肺、肾做冰冻切片进行PPV抗原的检查，5 h内就可得出检查结果。采用该技术检测PPV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪伪狂犬病毒（PRV），只有PPV出现特异性阳性荧光，而其他病毒未发现特异性荧光。因此该技术在临床上应用具有特异、敏感、可靠、快速等特点。

3.7 酶联免疫吸附试验

Hohdalsu等建立了猪细小病毒酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断技术。1997年姜永厚等[6]建立了ELISA双抗夹心法，该方法能从胎猪脏器中检测猪细小病毒抗原。刘俊辉[7]等采用差速离心、透析、聚乙二醇浓缩纯化PPV制备抗原，建立了检测PPV血清抗体的间接ELISA方法，通过对400多份样品的分析，结果表明该方法特异性强，易于操作，适用于现场血清学检测、诊断和大规模的流行病学调查。余波等运用ELISA方法对贵州省规模化养猪场和农村散养户共764头份猪血清样本（其中已免疫PPV 588头份，未免疫PPV 176头份）进行了PPV抗体水平检测。结果表明，未免疫猪群PPV的血清抗体阳性率为14.20%，而在免疫猪群PPV的血清抗体阳性率为71.94%。2007年李洪超等采用大肠杆菌表达的猪细小病毒非结构NS1蛋白为抗原，建立了PPV-NS1-ELISA，能够很好地区分PPV野毒感染与灭活疫苗接种病毒，而且敏感性高、特异性强、简单快速、检测成本低，是目前细小病毒感染鉴别诊断的有效方法。实践证明，ELISA检测PPV抗体与HI检测结果—致，且操作简便，特异性较高，适用于大规模的样品检测。

3.8 银加强胶体金技术

银加强胶体金技术(SECGA)是近年来的—种新技术，SECGA是继荧光素、同位素、酶标技术之后，又—重要的标记技术，它有其独特的优点，近年来已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记，同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能利用到。我国学者黄瑜[8]等报道了应用SECGA检测PPV，是免疫金技术在PPV诊断上的首次应用，对纯化PPV抗原的最小检测量为0.312 5 ng/点，其敏感性分别是间接Dot-ELISA和HA试验的8倍和1 000倍。SECGA和间接Dot-ELISA对77份样本检测的阳性率分别为83.1%和80.5%，阳性符合率为96.9% 。20份样本SECGA的检测结果与病毒分离和鉴定结果完全相符，表明SECGA不仅敏感性高而且特异性好，且SECGA无需特殊仪器设备，可用光镜或肉眼观察结果，更适于临床应用，经济、快速、简便、无污染，适于大批量的抗原样本的检测。

3.9 对流免疫电泳

在0.075 mo1/L离子浓度、pH8.6的巴比妥—巴比妥纳缓冲液加入1.2%的优质琼脂糖，再加入0.01%硫柳汞，水浴充分溶化后倾注成厚1.5 mm的凝胶板，按照常规琼扩法的操作方法进行打孔，孔径为3 mm，孔间距为6 mm，然后封底、加样。将加有样品的琼脂板放在电泳槽支架上，电泳1～2 h，取下琼脂板观察结果，阳性血清孔应与对应抗原之间出现清晰的沉淀线，阴性血清孔则无沉淀线。王川庆等利用该技术检测PPV抗原和抗体。抗原和血清无需特殊处理，在pH8.6、离子浓度为0.1 mol/L、电流4 mA的条件下，1～2 h便可得出结果。虽然该方法简单快速，但是与HA或HI相比，其敏感度偏低。

4 分子生物学诊断

应用核酸探针和PCR技术来诊断PPV极大地提高了诊断的敏感性和特异性，使得微量PPV的污染或感染的检测成为了可能。

4.1 常规PCR

PCR方法是一种用于在体外酶促扩增特定DNA片段的方法。目前，该方法已广泛用于猪细小病毒的检测。Molitor等对应用PCR方法诊断PPV 进行了最先报道。根据NADL-8和NADL-2的碱基序列设计合成了一对含有20个碱基的特异性引物和寡核苷酸探针，此方法最少可以检出100 fg的RFDNA，即1PFU的病毒感染量。李文刚等[9]对 PPV DNA结构蛋白VP1编码区228 bp片段进行了扩增，还以另一对引物对VP2编码区158 bp的DNA片段进行了扩增，并用Pvu Ⅱ和EcoR Ⅰ分析确定其特异性，最低可检出 10 fg的DNA模板。戎伟等[10]对 PPV VP2基因内的 158 bp进行了扩增，经EcoRI酶切鉴定，证实了该扩增片段的特异性，最低检出量为0.008病毒血凝单位。

4.2 巢式PCR

巢式PCR是利用2对PCR引物扩增目的片段的方法。它利用第1对引物扩增15～30个循环，再用第1次扩增的DNA片段内设定的第2对引物扩增15～30个循环。该方法比常规PCR方法更加特异，并且当样品内病原微生物含量极低时，常规PCR不一定能检测到，但是套式PCR可以克服该问题，进行更加微量的DNA检测。王汉中等[11]在PPV基因组VP2基因上选择了2对引物进行巢式PCR体外扩增，产物经凝胶电泳和生物素标记的探针鉴定证实具有特异性，同时其敏感性试验结果表明巢式PCR能检测到1 TCID50的病毒量，而一般PCR仅能检测到100 TCID50的病毒量。这表明套式PCR的灵敏度至少是一般PCR的100倍。引物除选择在PPV的结构基因区域外，R M Soares 等在NS-1的保守区选择引物，用于检测感染细胞系和临床样品，实验结果表明其敏感性比HA高100倍。Belak等[12]为了评价PPV疫苗的免疫力，对3头PPV疫苗免疫猪和3头未免疫猪同时进行PPV强毒感染，所生产的胎儿用HA、IF、PCR和巢式PCR检测。结果发现，免疫猪所产胎儿4种方法检测均为阴性，而未免疫猪所产胎儿的阳性检出率为：HA60.8%(14/23)，IF69.5%(16/23)，标 准 PCR60%(12/20)， 巢 式PCR82.6%(19/23)。此4种检测方法的相关系数十分接近(r<0.83)。虽然巢式PCR灵敏度更高，特异性更强，但是此项技术需要昂贵的试剂及熟练的操作人员，极大地限制了其应用。

4.3 原位杂交

原位杂交（ISHH）属于分子杂交的一种，其基本原理是在一定的温度和离子浓度下，利用已知碱基序列并带有标记物的核酸（如DNA、RNA、cDNA、寡聚核苷酸）作为探针，通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合形成杂交体，并通过与探针上标记物相应的检测系统，对组织细胞中待测核酸进行定位、定性和相对定量。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制，已成为当今分子生物学研究的重要手段。

4.4 核酸探针

核酸探针技术是一种分子水平的检测技术，具有快速、敏感、特异性强等特点，特别适用于疾病的早期诊断和类症鉴别诊断，是近20年来应用较多的一项诊断技术。Krell等率先将核酸探针技术用于PPV的诊断，结果最低可检出0.1 pg的DNA。A C Forster 等建立了光生物素 N-(4-azido-2-nitrophenyl)-N-(N-d- biotinyl-3-aminopropyl)-N’-methyl-1，3-propanedi-amine标 记DNA和RNA的非放射性探针技术，并与放射性同位素32P标记以及其他非放射性标记方法进行比较，结果表明，利用生物素标记的探针进行杂交，具有快速、可靠、安全和价格低等特点，同时也避免了放射性同位素标记的许多缺点。侯喜林等[13]用地高辛对猪细小病毒标记后制备探针，运用该探针对多株PPV病毒及具有相同临床症状的猪瘟病毒、日本乙型脑炎病毒、伪狂犬病病毒等进行检测。结果表明，该探针与猪细小病毒DNA杂交呈阳性反应，而与其他病毒反应呈阴性，且探针的最低检出限量为40 pg DNA。这表明该探针特异性强、敏感性高，适用于猪细小病毒的检测。Oraveerakul等报道利用非放射性标记探针检测培养细胞和胎儿组织中 PPV DNA，结果表明其敏感性比IFA高10～100倍。白红光等克隆了 PPV YK株保守序列NS1基因，将其纯化后，制备了NS1基因PCR产物探针，并用地高辛标记，结果表明，该探针对PPV检测的敏感性可达到l pg/μL。核酸探针技术与HA、SN相比，其特异性和敏感性更高，但该方法的技术含量高，只能在专业实验室应用，不适合大面积临床诊断和现场应用。

4.5 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是—种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术与常规的PCR相比，不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏性和特异性高，能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。目前，已广泛应用于分子生物学研究领域，特别是近几年来在动物疫病病原体的定性和定量方面得到了广泛应用。李明凤等[14]利用PCR技术扩增出PPV VP2基因保守区194 bp片段，并克隆到pGEMT载体上，以l0倍梯度稀释纯化后的质粒作为标准模板，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线，建立了PPV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL，并且与PRRSV、PCV2、JEV、PRV、CSFV和猪流感病毒不发生交叉反应，具有良好的特异性和重复性。研究人员将SYBR Green I Real-Time PCR与常规PCR相比，发现其敏感性提高了100倍。

4.6 环介导的等温扩增反应(LAMP)

LAMP由日本学者于2000年建立。它利用2～3对引物(包括1对外部引物、1对内部引物和1对环引物)和链置换DNA聚合酶，在等温条件下，几十分钟就可扩增出靶序列。由于该方法用时短，对设备要求低，且比普通PCR的敏感性高，非常适合于基层和现场操作使用。目前已有学者将该技术运用到PPV的检测中，根据PPV VP2基因设计4条引物，利用LAMP在62 ℃的恒温条件下快速鉴别PPV，其敏感度可以达到5拷贝数，并且没有非特异性扩增。利用该法对125份临床样品进行检测，PPV检出率为97.6%，比常规PCR灵敏度高。刘业兵等[15]利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪 对PPV LAMP过 程 进 行 了实时分析，筛选出可靠、最佳的反应体系，建立了快速、特异的检测PPV的LAMP方法，其检出限量为 0.23 TCID50，具有很高的敏感性。同时，他们在LAMP反应结束后，向反应体系中加入SYBR Green I，并将染色后肉眼观察的结果与LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪的检测结果进行对比，结果一致。该检测方法具有操作简单、设备要求低、快速、特异、灵敏等特点，适合用于临床上快速检测PPV。这就为PPV诊断的现场操作和快速诊断奠定了基础。

4.7 多重PCR鉴别诊断猪流产性疫病

由于猪细小病毒常与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒等呈混合感染。若采用常规的诊断方法如病毒的分离鉴定及血清学方法对这3种病进行诊断，费时费力。因此已经有研究学者建立了可以同时诊断多种疫病的多重PCR诊断方法。该方法是在同一PCR体系中，同时加入多对引物，实现了对多种目的基因同时扩增。该诊断方法具有快速、敏感、特异、省时省力等优点。余丽芸等[16]建立了检测CSFV、PPV、PRV的多重PCR诊断方法，该方法可以检测 到14.5 ng/L的CSFV，27.1 ng/L的PPV及31.4 ng/L PRV的核酸模板，特异性很高。

综上所述，用于PPV感染的诊断方法很多，各种方法具有不同的优缺点，相对而言，目前应用较多的是HA和HI试验，这2种方法基本能满足常规的病原检测和血清流行病学调查等需要。要得到病原学的确诊，则最好利用病毒分离鉴定方法，其他血清学诊断方法则根据不同的实验室条件和情况选择应用。而核酸探针和PCR等分子生物学诊断方法由于其灵敏度高、特异性好，在实验室的应用越来越广。随着PPV的研究不断深入，分子生物学技术的不断发展，一定会有更加灵敏、更加准确、操作更加简便的PPV诊断技术不断地出现和应用。

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