甲型H1N1流感病毒NS1蛋白核仁定位的研究

赵宗正，涂加钢，张文婷，胡 勇，周红波，金梅林

（华中农业大学动物医学院 农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070）

流感病毒属于正粘病毒科，其全基因组由8个分节段的负链RNA片段组成，共编码11种蛋白。2009年4月份爆发于墨西哥的甲型H1N1流感在短短几个月内迅速在全球范围内传播，引起了人们的广泛关注。甲型H1N1流感病毒是三源重配病毒，PB2、PA来自H1N1禽流感病毒，PB1来自H3N2人流感病毒，HA、NP、NS来自北美经典H1N1猪流感病毒，而NA、M来自欧系禽源H1N1猪流感病毒[1,2]。

流感病毒的NS1是流感病毒的重要毒力因子，也是流感病毒唯一的非结构蛋白[3]。NS1蛋白起初在宿主细胞浆合成，然后很快转移到细胞核，并在感染早期积聚在细胞核，感染后期则积聚于核仁中，形成致密的包涵体[4]，是病毒复制和传播的重要调节蛋白。NS1蛋白是一个多功能蛋白，对宿主细胞蛋白质合成具有抑制作用，能够拮抗宿主干扰素的产生，并可以上调“凋亡阈值”来延缓宿主细胞启动凋亡程序[4,5]。Skehel[6]研究发现，NS1蛋白在病毒复制的早期就大量表达，仅出现于被流感病毒感染的细胞中，而在病毒粒子内部不存在NS1蛋白，因此通过血清学方法可以用来区别灭活苗免疫与野毒感染的动物。甲型流感病毒的NS1蛋白含有202～237个氨基酸，不同的毒株之间存在着长度差异，一般为230个氨基酸。NS1蛋白有两个核定位信 号（nuclear localization signal，lNSL），N末 端的35～41位是第一个核定位信号（NLS1），C末端203～237含有第二个核定位信号（NLS2），同时含有一个核仁定位信号。2009年甲型H1N1流感病毒NS1蛋白只有219个氨基酸，存在11个氨基酸的截短现象。为了研究这种截短现象是否影响其核仁定位情况，本试验利用表达不同长度NS1（NS1-219、NS1-230、NS1-237）的3种重组流感病毒感染哺乳动物细胞（A549），对其NS1蛋白的核仁定位情况进行了研究，进而探究NS1的截短是否对甲流的核仁定位有影响。

1 材料和方法

1.1 载体 细胞和病毒 PEGX-KG（以下简称KG）载体购自全式金生物技术有限公司；甲型H1N1流感病毒由武汉生物制品研究所提供；rPR8-甲（NS1-219）、rPR8-甲（NS1-230） 和rPR8-甲（NS1-237）为表达不同长度NS1蛋白的重组流感病毒，是本实验室涂加钢博士通过PCR定点突变的方法在甲型H1N1流感病毒的NS基因上让终止密码子后移，得到表达不同长度NS1蛋白的基因片段，然后通过感染性克隆技术以毒株A/Puerto Rico/8/34 H1N1（PR8）为背景，替换甲型H1N1流感病毒的NS基因构建重组病毒；大肠杆菌BL21和DH5α及A549细胞均由本实验室保存；日本大白兔（体重约1.5 kg）购自湖北省疾病防治与控制中心。

1.2 主要的试剂工具酶 各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、RNA-SOLV® Reagent RNA Isolation Solvent购自OMEGA公司；UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公司；质粒提取试剂盒购自北京全式金公司；核酸分子量标准物（DL2000、DL15000）、One step RNA PCR kit（AMV）及高保真Taq酶primerstar购自大连宝生物工程（TaKaRa）公司；酵母浸出粉及胰蛋白胨（Tryptone Soya Agar）购自英国OXOID公司；DAB显色试剂盒购自中山金桥；绿色荧光二抗购自博士德生物工程有限公司；琼脂粉购自北京原平皓生物技术公司，日本进口分装；所需其他各种试剂、药品均为分析纯。

1.3 NS1基因的克隆 根据NCBI公布的2009年甲型H1N1流感病毒的NS基因序列设计引物。上游引物：5'-CGAATTCATGGACTCCAACACCATG-3'（引入EcoR I酶切位点）；下游引物：5'-CCGTCGACTCATTTCTGCTCTGGAGG-3'（引入SalI酶切位点）。首先将病毒在9日龄鸡胚上增值并自尿囊液提取病毒RNA，利用通用引物U12（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）反转录制备cDNA，然后经PCR扩增NS1基因。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s， 72℃延伸2.5 min，运行30个循环；最后 72℃再延伸10 min，然后降温到16 ℃。反应结束后，PCR产物各取5 μL，在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，剩余置4 ℃保存备用。PCR产物和载体经EcoR I和SalI双酶切，克隆至KG载体，构建重组质粒KG-NS1，并进行酶切、测序鉴定。

1.4 表达和纯化NS1蛋白 将鉴定正确的重组质粒转化到表达菌BL21中，并进行酶切、测序鉴定。分别以1 mmol/L和0.1 mmol/L IPTG（16 ℃）诱导表达过夜，并进行SDS-PAGE分析。将NS1重组蛋白大量表达，采用GST柱亲和层析纯化。

1.5 NSI多克隆抗体的制备 以纯化后的NS1蛋白为抗原免疫日本大白兔。采用颈部皮下多点注射的方法分3次免疫，每次免疫所用的抗原量分别为300、500、500 μg。初次免疫采用完全弗氏佐剂，二免和三免采用不完全弗氏佐剂，按照1:1与抗原混合，每次免疫间隔14 d。第三次免疫后14 d心脏采血，分离血清并用Western blot 检测抗体。

1.6 表达不同长度NS1蛋白的核仁定位 rPR8-Mex（NS1-219）、rPR8-Mex（NS1-230） 和 rPR8-Mex（NS1-237）三种重组流感病毒以3 MOI分别感染A549细胞，感染6 h后，用PBS洗3次；再以1%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗3次；加1%BSA 37℃封闭1 h，以200倍稀释NS1多抗37℃孵育2 h，PBS洗3次然后用荧光二抗（抗兔）37℃孵育1 h，PBS洗3次，在奥林巴斯显微镜下观察。

2 结果

2.1 NS1基因RT-PCR扩增产物 琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增产物为650 bp，与目的片段大小相符，说明已成功扩增NS1基因，如图1所示。

图1 NS1基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR results of NS1 gene

2.2 重组质粒酶切鉴定结果 将重组质粒KG-NS1转化到DH5α和BL21后摇菌提质粒，产物经EcoR I和SalI双酶切鉴定，琼脂糖电泳凝胶结果显示，得到的两个目的片段大小分别为650 bp和5000 bp，与预期相符，如图2 所示，且测序也证明构建成功。

图2 重组KG-NS1载体的酶切鉴定结果Fig.2 Recombinant vector digested with EcoRⅠand SalⅠ

2.3 目的蛋白的表达与纯化 将菌体37 ℃振荡培养3 h后，分别加至终浓度为1 mmol/L和0.1 mmol/L IPTG，16 ℃诱导过夜。SDS-PAGE结果显示在IPTG终浓度为1 mmol/L的条件下目的蛋白在上清和沉淀中都有融合表达，大小为46 kDa（图3），而在0.1 mmol/L IPTG和未诱导条件下均无此蛋白带。以1 mmol/L的IPTG诱导大量表达目的蛋白，采用GST柱亲和层析纯化（图4）。

图3 NS1基因融合蛋白的SDS-PAGE结果分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of NS1 fusion protein

图4 纯化以后的NS1蛋白Fig.4 Purif i ed NS1 protein

2.4 抗体的检测 将纯化后的蛋白跑SDS-PAGE并电转至NC膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，将兔血清（一抗）37 ℃孵育1 h，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，37 ℃孵育1 h，DAB显色（图5）。

图5 NS1基因融合蛋白Western blot检测Fig.5 Western blot analysis of the expression of NS1 fusion protein

2.5 核仁定位rPR8-甲（NS1-219）、rPR8-甲（NS1-230）和rPR8-甲（NS1-237）三种重组流感病毒在A549细胞的定位，通过间接免疫荧光结果显示都能定位于细胞核，但不能定位于核仁(图6)。

图6 rPR8-甲（NS1-219）、 rPR8-甲（NS1-230）和rPR8-甲（NS1-237）流感病毒的核定位Fig.6 The localizations of Inf l uenza virus rPR8-（NS1-219），rPR8-（NS1-230）and rPR8-（NS1-237）

3 讨论

2009年甲型H1N1流感病毒能够在人与人之间迅速传播，并呈现暴发流行。NS1蛋白可能在其致病机制上发挥了重要作用。

流感病毒的NS1蛋白有两个NSL，NS1在N末端的35～41位是第一个核定位信号（NLS1），C末端203～237位含有一个核定位信号（NLS2），同时也是一个核仁定位信号[7]。 核仁是细胞内核糖体RNA加工与成熟的地方。核仁定位信号是病毒蛋白调节细胞基因表达、细胞增殖、编程性死亡的重要因素[8-10]。已经证实流感病毒NS1蛋白的核仁定位抑制rRNA的合成[11]。Melen等[7]的研究表明流感病毒A/Udorn/72（H3N2）的NS1蛋白有237个氨基酸，能定位于核仁，缺失其C末端231～237位氨基酸后仍可以定位于核仁，但是缺失221～237位氨基酸就不能定位于核仁。2009年甲型H1N1流感病毒NS1蛋白只有219个氨基酸，存在11个氨基酸的截短现象。Hale等[12]对H1N1猪流感病毒NS1蛋白进行序列分析发现从20世纪60年代中期分离的H1N1猪流感病毒都存在这样的11个氨基酸的截短现象。那么这种自然存在的截短是不是H1N1猪流感病毒的一种进化特征？我们猜想是否这种截短的NS1蛋白不能定位于核仁，而将其延伸到230或237个氨基酸时就能定位于核仁？因此本研究通过原核表达甲型H1N1流感病毒的NS1蛋白并制备多克隆抗体，利用本实验室涂加钢博士通过感染性克隆技术构建的表达不同长度（219、230、237个氨基酸）NS1蛋白的重组流感病毒rPR8-甲（NS1-219）、rPR8-甲（NS1-230）和rPR8-甲（NS1-237）进行核仁定位研究。结果发现三种重组病毒都不能定位于核仁。Melen等[7]的进一步研究证明，只要在C末端的224和229位分别为精氨酸（R）和赖氨酸（K），就可以定位于核仁。而2009年的甲型H1N1流感病毒在224和229位分别是精氨酸（R）和谷氨酸（E），不是碱性氨基酸R和K[7]。如果甲型H1N1流感病毒在224和229位分别为精氨酸（R）和赖氨酸（K），其NS1蛋白是否可以核仁定位还有待于进一步研究。

总之，了解2009年甲型H1N1流感病毒的NS1蛋白核仁定位情况，将有助于我们进一步了解甲型H1N1流感病毒的复制和传播机制以及其毒力和致病机理。

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