I型鸭肝炎病毒vp3基因的截短表达及鉴定

罗 玄 ，张海涛，尹秀凤，黄显明，靳宇田 ，张小飞, ，潘 玲

(1.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；2.南京天邦生物科技有限公司，南京 211102；3.江苏省农科院兽医研究所，南京 210014)

I型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1,DHV-1)是引起雏鸭急性高度致死性传染病的病原，早在1949年美国学者Levine首次分离并报道了DHV[1]，但直到最近几年，才有学者陆续完成了DHV全基因组序列测定[2-4]。根据国际病毒分类委员会第九次报告，DHV-1属于小RNA病毒科Avihepatovirus病毒属[5]。DHV-1病毒基因组为长约7.7 kb的单链正股RNA分子，含有1个大的开放阅读框(open reading frame, ORF)，一级编码产物为一个多聚蛋白前体。该多聚蛋白在随后的翻译加工过程中，可被再次裂解，产生3种结构蛋白(VP0、VP3和VP1)和9种非结构蛋白2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C和3D[2]。

由于目前尚无DHV-1结构蛋白的功能的相关报道，为了对DHV-1 VP3蛋白的免疫学功能进行研究，本试验尝试对随机选择的vp3截短基因进行表达，以获得VP3蛋白的部分截短蛋白，为将来为DHV-1 VP3蛋白的抗原表位、诊断试剂和新型疫苗等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体和血清 DHV-1 A66株为安徽省农业科学院提供的鸡胚适应株；工程菌DH5α、Rosetta-gami(DE3) pLysS、表达载体pET-32a(+)均由南京天邦生物技术研究所保存；克隆载体pMD 18-T购自TaKaRa公司；DHV-1阳性、阴性血清为南京天邦生物技术研究所制备及保存。

1.2 主 要 试 剂 RNAiso Plus、M-MLV反 转 录酶、RNA酶抑制剂、T4 DNA连接酶、DL 2000 Marker、rTaqDNA 聚合酶、限制性内切酶BamH I、EcoR I、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit均购自TaKaRa公司；HRP标记的山羊抗鸭IgG二抗购自KPL公司；Ni-NTA HiBind Purification Kit购自Novagen 公司；BCA蛋白定量试剂盒、DAB显色试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；DEAE-Sepharose阴离子柱购自北京瑞达恒辉科技发展有限公司。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank登录的DHV-1(A66株，DQ886445) vp3基因序列1-468位设计引物，上游引入BamH I位点，下游使用vp3自带的EcoRI酶切位点。将vp3基因序列1-468位命名为vp468。阳性克隆筛选用Novagen公司pET系列载体通用引物T7 promoter primer#69348-3和T7 terminator primer #69337-3。引物如下（下划线部分为酶切位点）：

FVP468：5'-CTC GGA AAG CGT AAA CCA T-3'（BamH I）

RVP468：5'-G GAA TTC TGG CAT TGT GCC AAG CTC-3' (EcoR I)

FT7 promoter primer：5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'

RT7 terminator primer：5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'

1.4 病毒RNA的提取 DHV-1 A66株接种于8～10日龄鸡胚尿囊腔，收集24～96 h内死亡的鸡胚组织，按照TaKaRa RNAiso Plus说明书提取病毒总RNA。

1.5 目的基因vp468的扩增 采用TaKaRa公司的M-MLV反转录酶进行反转录，反应过程按说明书进行。PCR扩增使用25 μL反应体系，取上述反应的cDNA 模板2 μL，进行PCR扩增：94℃ 预变性3 min；94℃ 变性 30 s，57℃ 退火 30 s，72℃ 延伸1 min，30个循环；72℃ 延伸10 min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段。目的片段连接到pMD18-T载体，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，挑选单菌落，进行菌落PCR（引物FVP468，RVP468）鉴定。阳性克隆质粒命名为pMD-VP468。

1.6 重组质粒的构建及鉴定 将1 μg pET-32a(+)和1 μg pMD-VP468分别经BamH I和EcoR I双酶切（10 μL体系，3 h），1%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收约5800 bp的pET-32a(+)片段和468 bp的vp468片段。连接反应使用10 μL体系，pET-32a(+)片段与vp468片段按照摩尔比1:3，16℃连接过夜，重组质粒命名为pET-VP468。取连接产物1 μL，TSS法转入200 μL DH5α感受态细胞：连接产物与感受态细胞混合后，冰上放置30 min，加入SOC培养基800 μL 37℃ 振荡培养30～60 min，均匀涂布于氨苄青霉素抗性平板。阳性克隆筛选使用菌落PCR法，引物为通用引物FT7 promoter primer和 RT7 terminator primer。 提取鉴定正确的pET-VP468质粒，保存备用。

1.7 重组质粒的原核表达 将阳性重组表达质粒pET-VP468与对照载体pET-32a(+)分别转化E.coliRosetta-gami (DE3) pLysS感受态细胞。分别挑取单个菌落，接种于5 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中，摇床（37℃，250 r/min）培养至OD600值约1，将菌液710×g离心10 min，弃去上清。将菌体沉淀用5 mL含200 μg/mL氨苄青霉素的TB培养基重新悬浮，加入终浓度1.0 mmol/L的IPTG振荡培养（37℃，250 r/min），诱导3 h。硫氧还原蛋白-鸭肝炎截短VP3重组融合蛋白命名为Trx-VP468。

1.8 Trx-VP468 的纯化 诱导表达菌液710×g离心10 min，弃去上清，超声裂解菌体（裂解缓冲液：20 mmol/L Tris-Cl、150 mmol/L NaCl 、PMSF、pH 8.0），6500×g离心30 min，收集包涵体。溶解包涵体（20 mmol/L Tris-Cl、8 mol//L尿素、500 mmol/L NaCl、40 mmol/L咪唑，pH 8.0），6500×g离心30 min，收集上清。蛋白纯化使用Ni-NTA层析柱，按照Novagen 公司Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明进行，洗脱缓冲液为 20 mmol/L Tris-Cl、8 mol/L尿 素、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑，pH 8.0。洗脱液透析（20 mmol/L Tris-Cl、8mol/L尿素， pH 8.0）去除NaCl，再经DEAE-Sepharose阴离子柱进一步纯化。使用BCA蛋白定量试剂盒进行浓度测定，蛋白未做复性保存于8 mol/L尿素中。

1.9 表达产物的鉴定

1.9.1 SDS-PAGE检测 诱导结束，取80 μL菌液，加入20 μL 5×SDS上样缓冲液沸水浴10 min，以15%的还原性SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮兰染色、脱色后观察结果，通过凝胶灰度分析蛋白纯度。

1.9.2 Western blot分析 纯化后的融合蛋白Trx-VP468经15%的还原性SDS-PAGE凝胶电泳，然后转印至硝酸纤维素膜上（4℃，15 V，过夜），用含10%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h后与鸭抗DHV-1阳性血清（1:200，1%脱脂奶粉，TBST）于37℃作用1.5 h，同时设立阴性血清对照。反应完毕，TBST洗涤5 min重复3次，硝酸纤维素膜与二抗（HRP标记的羊抗鸭IgG，1:5000，1%脱脂奶粉，TBST）37℃作用0.5 h，TBST洗涤5 min重复3次。按照DAB显色试剂盒使用说明，使用1 mL DAB显色液，室温避光显色10 min，自来水或TBST冲洗终止反应。

2 结果

2.1vp468基因的扩增 提取DHV-1病毒总RNA，通过反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，得到一条约470 bp的片段，与预期结果（468 bp）相符（图1）。扩增产物经胶回收后，克隆至pMD18-T载体，得到重组质粒pMD-VP468。经菌落PCR鉴定，与预期结果一致（图2）。

图 1 RT- PCR 扩增结果Fig.1 The result of RT- PCR

图 2 质粒pMD-VP468的鉴定Fig.2 Assessment of plasmid pMD-VP468

2.2 重组质粒的构建、鉴定及表达 vp3截短基因vp468亚克隆到表达载体pET-32a(+)中，经T7 Primer PCR鉴定筛选出阳性重组表达质粒pETVP468（图3）。将pET-VP468和空载体pET-32a(+)分别转入E.coliRosetta-gami (DE3) pLysS中，经IPTG诱导，15%的还原性SDS-PAGE凝胶电泳鉴定显示，构建的重组质粒pET-VP468表达出约36 kDa的蛋白产物，载体pET-32a(+)表达出20 kDa左右的蛋白产物，与预期结果相符。重组蛋白带有His标签，使用Ni2+亲和层析柱和DEAE-Sepharose阴离子柱进行纯化，纯化的融合蛋白经SDS-PAGE电泳及凝胶灰度分析，蛋白纯度约为95%（图4）。Trx-VP468融合蛋白未做复性保存于8 mol/L尿素中，经BCA蛋白定量试剂盒测定，终浓度约为2.5 mg/mL。

图 3 质粒pET-VP468的鉴定Fig.3 Assessment of plasmid pET-VP468

图 4 融合蛋白Trx-VP468的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein fused Trx-VP468

2.3 Western blot分析结果 将纯化后的Trx-VP468融合蛋白和pET-32a(+)全菌蛋白进行还原性SDSPAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上进行免疫印迹分析，结果显示融合蛋白Trx-VP468能够与DHV-1阳性血清反应，在36 kDa处有一条明显的蛋白质印迹带，而与DHV-1阴性血清不反应，pET-32a(+)全菌蛋白与DHV-1阳性血清不反应，说明表达的重组蛋白能够被DHV-1鸭阳性血清特异性的识别，Trx-VP468获得了正确表达（图5）。

图 5 融合蛋白Western blot 分析结果Fig.5 Western blotting analysis of the purif i ed fused protein

3 讨论

本研究首先扩增出DHV-1 vp3截短基因（468 bp），与表达载体pET-32a(+)连接，构建了截短基因重组质粒pET-VP468，用大肠杆菌原核表达系统成功的表达了DHV-1 截短的VP3融合蛋白Trx-VP468。Western blot检测结果表明，表达的截短蛋白Trx-VP468与DHV-1 阳性鸭血清可产生特异反应，不能与DHV-1阴性血清反应，说明构建的截短蛋白Trx-VP468获得了正确表达。

目前，DHV-1的检测还依赖于病毒的分离和中和实验，而ELISA的应用受限于抗体的亲和力低，灵敏度和稳定性较差。因此，我们尝试使用原核表达的方法，对DHV-1的主要结构蛋白VP3进行表达，用表达获得的蛋白制备单抗或多抗，以期为DHV-1检测试剂盒的开发奠定基础。

由于全基因序列测定在2006年才完成，在分子水平上对DHV-1的研究刚刚起步，Pan等[6]率先对DHV的内部核糖体结合位点（internal ribosome binding sites，IRES）进行了研究，应用缺失突变技术研究DHV的IRES结构。关于DHV-1三种结构蛋白VP0、VP1、VP3的功能研究，我们认为可以参考小RNA病毒科中其他病毒的研究成果。在小RNA病毒科中，肠病毒的VP1蛋白编码主要的B抗原位点并具有中和位点[7]。Borca等[8]利用反向遗传学和突变技术证实FMDV（口蹄疫病毒，Footand-mouth disease virus）VP3蛋白某些氨基酸的变异可以导致遗传性状的改变；Bosch等[9]研究表明HAV（甲型肝炎病毒，Hepatitis A virus） VP3蛋白110～121aa含有一个连续的抗原表位在抗病毒感染方面起到一定的作用，另有学者报道HAV的T抗原表位主要位于VP3蛋白[10]。

DHV基因组的功能研究尚处于起始阶段，VP1和VP3蛋白的功能研究都很少，在实验的过程中，我们运用了截短表达策略，一方面降低了蛋白表达的难度，另一方面也为将来抗原表位的筛选奠定了基础。vp3基因内部含有两个EcoR I（463位，601位）酶切位点，另外，也可以利用vp3基因内部的其他酶切位点，可以构建一系列截短的VP3表达载体，结合突变技术，对VP3蛋白的功能进行研究。本研究首次成功的表达了VP3蛋白的截短蛋白，为鸭肝炎结构蛋白VP3抗原表位的筛选，以及蛋白的结构与功能研究奠定了良好基础。

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[6] Pan M, Yang X, Zhou L,et al.Duck Hepatitis A virus possesses a distinct type IV internal ribosome entry site element of picornavirus[J].J Virol, 2012,86(2):1129-1144.

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