Apollon siRNA抑制肺癌细胞生长并提高放疗敏感性

李 立 陈建发(广东医学院广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023)

有关肺癌发生发展分子机制的研究虽然已取得显著进展，但肺癌的治疗效果仍不令人满意〔1〕。如非小细胞肺癌(NSCLC)，其对放疗的反应率低下，5年生存率仅 7% ～10%〔1〕。有两个原因限制了NSCLC放疗效果:肿瘤的放疗抗性及放疗对正常组织的毒性。NSCLC产生放疗抗性的机制仍不明了，虽然一些研究显示可能与p53突变、survivin过表达有关〔2〕。目前，在肺癌的治疗中还未出现与放疗并用的分子靶向治疗，因此，有必要鉴定与放疗抗性有关的基因，以便寻找新药并提高放疗敏感性。本研究采用siRNA技术，体外沉默NSCLC细胞内细胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员Apollon的基因表达，检测NSCLC细胞对放疗敏感性的变化，并探讨Apollon作为癌症治疗靶点的可能性。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 NSCLC细胞株为转染野生型及突变型p53基因的H1299/wtp53及H1299/mp53，由日本东北大学加龄医学研究所医用细胞资源中心提供，于含10%新生牛血清(FBS，HyClone)的RMPI 1640培养液(Sigma)内，在37℃、含5%CO2的饱和湿度空气中培养。

1.2 siRNA转染 播种H1299/wtp53或H1299/mp53细胞5×105个于直径10 cm的培养皿内，将培养液调至8 ml，培养24 h。712 μl的 Opti-MEMImedium (GIBCO)与 8 μl 100 μmol/L的 Apollon siRNA(正义链 5'-CAG ACC AGU GCA AGA UCA G-3'，反义链 5'-CUG AUC UUG CAC UGG UCU G-3';Thermo)混匀，设为 A液;64 μl的 Opti-MEMI medium 与16 μl的 Oligofectamine(Invitrogen)混匀，设为 B 液;A、B 液混匀，室温孵育15～20 min。弃除培养液，将3.2 ml的Opti-MEMI medium及A、B液的混合液加入培养皿，Apollon siRNA的最终浓度则为200 nmol/L。4 h培养后，添加1 ml的新生牛血清于培养皿内，37℃、5%CO2的条件下培养24 h，取部分细胞抽提RNA用于RT-PCR分析，剩余细胞则用于后续实验。对照siRNA(Thermo)转染方法同上。

1.3 RNA提取及RT-PCR 总RNA提取采用TRIZOL(Invitrogen)试剂，并按试剂所付操作指南操作。每1×106～3×106个细胞加TRIZOL 1 ml，裂解细胞、室温孵化;以每1 ml TRIZOL加0.2 ml的比例添加CIAA(Chloroform:Isoamyl alcohol=24∶1)(Wako)，混匀、室温孵化;离心，将水层部分移入新的微离心管内，以1 ml TRIZOL加0.5 ml IP(2-Propanol)(Wako)的比例添加 IP(Isopropyl alcohol，Wako)，混匀、室温孵化;离心，除去上清;以1 ml TRIZOL加1 ml 75% 乙醇的比例添加75%乙醇，离心，除去上清、干燥;加适当diethylpyrocarbonate(DEPC)水溶解。取总RNA 500 ng，用于cDNA的合成。DnaseⅠ处理后，应用逆转录试剂(Invitrogen)在20 μl的反应体系中，按试剂所附操作指南进行逆转录反应。反应后，添加30 μl蒸馏水，使被合成的cDNA总体积为50 μl，用于确定Apollon基因表达的RT-PCR分析。

取蒸馏水将7.5 μl的2×Quantitect SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN)、各1 μl的 Apollon正反引物(正义链5'-CGT TGT GAT TAA TGC CGA ACT TG-3'及反义链5'-GGT CTA GCC CTT GCA ATT TCT CA-3')(10 μmol/L)及 1 μl cDNA调整到15 μl，采用 iCycler(Bio-Rad)进行 PCR 反应，并以β-actin引物(正义链5'-GCC AAC CGC GAG AAG ATG A-3'及反义链:5'-CAT CAC GAT GCC AGT GGT-3')为内参。

1.4 克隆生成分析 采用X线发生装置(Model MBR-1520R，Hitachi)，分别以 0、1、2、4、6、8 Gy 的剂量照射上述经转染 siRNA的NSCLC细胞。照射后，将细胞以200个/孔的比例播种于12孔细胞培养板，于培养箱内培养7 d。培养后，检测细胞克隆数，每个克隆细胞数需超过20个以上，计算克隆生成率(Surviving fraction)并绘制曲线。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 Apollon siRNA抑制Apollon基因表达 无论是在H1299/wtp53细胞内，还是在H1299/mp53内，与对照siRNA相比较(0.053，0.071)，Apollon基因表达均有下降，提示 Apollon siRNA可靶向沉默Apollon基因表达。

2.2 沉默Apollon基因对细胞克隆形成的影响 Apollon siRNA处理并经7 d培养后，在未经X线照射的情况下，无论H1299/wtp53还是 H1299/mp53，细胞克隆生成率〔(61.2±3.8)%vs(100±4.6)%，P=0.000和(60.1±4.7)%vs(100±5.3)%，P=0.001〕均显著降低。

2.3 p53状态对NSCLC细胞放疗效果的影响 在未经Apollon siRNA处理的情况下(仅以对照siRNA处理)，虽然H1299/wtp53及H1299/mp53在1、2、4、6 Gy处的细胞克隆生成率没有显著差异，但在8 Gy处，H1299/wtp53较H1299/mp53细胞克隆生成率显著下降(表1)。

表1 p53状态对肺癌细胞克隆生成率的影响(，%)

表1 p53状态对肺癌细胞克隆生成率的影响(，%)

0 Gy 1 Gy 2 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy H1299/wtp53 3 100±4.6 90.5±5.8 75.1±2.9 40.9组别 n±4.5 15±5.8 1.4±0.7 H1299/mp53 3 100±5.3 92±5.8 79.2±5.6 37.9±2.1 15.7±4.2 5.1±1.4 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 0.017

2.4 沉默Apollon基因对放疗敏感性的影响 在任何X线剂量处，沉默Apollon基因均可降低NSCLC细胞克隆生成率，并且 H1299/wtp53及 H1299/mp53分别在1、2、4 Gy处及2、4 Gy处细胞克隆生成率下降幅度具有显著性(表2)。

表2 Apollon siRNA对肺癌细胞H1299/wtp53、H1299/mp53克隆生成率的影响(，%)

表2 Apollon siRNA对肺癌细胞H1299/wtp53、H1299/mp53克隆生成率的影响(，%)

组别 n 0 Gy 1 Gy 2 Gy 4 Gy 6 Gy 8 Gy H1299/wtp53 control siRNA 3 100±4.6 90.5±5.8 75.1±2.9 40.9±4.5 15±5.8 1.4±0.7 Apollon siRNA 3 100±6.2 71.7±4.7 50.9±13.1 27.5±4.6 5.7±1.1 1.1±1.1 P值 ＞0.05 0.012 0.035 0.023 ＞0.05 ＞0.05 H1299/mp53 control siRNA 3 100±5.3 92±5.8 79.2±5.6 37.9±2.2 15.7±4.2 5.1±1.5 Apollon siRNA 3 100±7.8 83.9±7.5 55.9±11.5 27.5±4.3 10.9±2.2 1.4±2.5 P值 ＞0.05 ＞0.05 0.034 0.021 ＞0.05 ＞0.05

3 讨论

Apollon ，又称Bruce或BIRC6，是IAP家族最大成员，在氨基端含有一个杆状病毒IAP重复结构域，在羧基端则含有一个泛素结合酶结构域。虽然Apollon抗细胞凋亡的生理功能还未明了，但已有信息表明Apollon通过泛素化降解促细胞凋亡蛋白Smac/DIABLO及抑制caspase活性以实施其细胞保护功能〔3〕。有报道称Apollon在一些耐DNA损伤剂的脑肿瘤细胞内表达上调，并且其过表达与儿童急性髓细胞白血病不良预后关系密切〔4〕。通过反义寡核苷酸或siRNA介导的Apollon下调可使肿瘤细胞更易于发生由抗癌药物所诱导的细胞凋亡〔3，5，6〕，因此，沉默Apollon基因表达可能有利于癌症治疗。

不同的p53状态可通过细胞凋亡诱导能力的不同影响癌细胞放疗效率〔7〕，一些采用突变型p53转染癌细胞株的研究表明，突变型p53蛋白组成性表达可导致放疗抵抗〔8〕，临床研究也显示携带野生型p53的宫颈癌患者放疗后有更佳的预后〔9〕，提示癌症放疗效果似乎基于p53基因状态。在本研究中，虽然在1、2、4、6 Gy处，在未经 Apollon siRNA 处理的情况下，H1299/wtp53、H1299/mp53细胞对放疗的反应没有显著差异，但在8 Gy处，H1299/wtp53克隆生成能力较H1299/mp53显著降低，表明p53在某种程度上参与了X线杀灭肺癌细胞的过程。

在本研究中，Apollon siRNA可抑制Apollon基因表达，并导致H1299/wtp53、H1299/mp53细胞增殖活性下降、克隆生成能力减弱，从另一角度显示出Apollon对细胞的保护功能。有研究表明，Apollon失活可通过p53依赖途径或非p53依赖途径诱导细胞凋亡发生〔6，10〕，提示Apollon siRNA处理可提高肺癌细胞对放疗的敏感度。

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