SU11248对白血病细胞HL-60增殖及凋亡作用的实验研究①

陈惠瑜 施腾飞 成 玲 林东红 罗玲清 胡建达

(福建省妇幼保健院检验科，福州350001)

全反式维甲酸(ATRA)用于治疗急性早幼粒白血病(APL)和格列卫(STI571)用于治疗慢性粒白血病标记着血液系统恶性肿瘤的分子靶点治疗时代已经到来。血液系统恶性肿瘤有很多好的分子靶点，而且许多针对这些靶点的新药正在临床试验当中。苹果酸舒尼替尼(Sunitinib malate，Sutent，Su11248)是一种新的多靶点酪氨酸激酶抑制剂，具有抗肿瘤和抗血管生成的双重作用。2006年1月FDA批准本品用于甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate，Ggleevec)治疗失败或不能耐受的胃肠道间质瘤患者以及晚期肾细胞癌患者［1，2］，对其他实体瘤的治疗应用也已进入Ⅱ期临床阶段，但其与恶性血液病关系的研究尚不多。国外有实验初步表明用SU11248可以诱导急性髓细胞样白血病病人部分缓解［3］，因此，本实验拟以人髓系白血病细胞株HL-60为白血病模型，分析SU11248对白血病细胞HL-60的作用及可能机制，以期为白血病的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人髓系白血病细胞株HL-60由福建省血液病研究所传代保存;SU11248购自biocompound公司，用二甲亚砜溶解，-20℃避光保存备用;RPMI1640培养液为 Gibco公司产品;二甲亚砜 、MTT溶液为Sigma公司产品;胎牛血清(FBS)为杭州四季青公司产品;AnnexinV Detection Kit为BD公司产品;凋亡周期检测试剂盒为北京天来生物医学科技有限公司产品;HaltTMProtease Inhibitor、Protein Extraction Reagent为 Pierce 公司;bcl-2、bax、caspase-3单克隆抗体 (鼠抗人)、Western blot Luminol Reagent:sc-2048为Santa Cruz公司产品;辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG、硝酸纤维膜(NC膜)均由北京中山生物技术公司提供。

1.2 方法

1.2.1 建立细胞培养体系 HL-60细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，2天传代1次，培养中的细胞密度均保持在(1.0～5.0)×105ml-1，取对数生长期细胞作为实验用细胞。

1.2.2 MTT比色法检测SU11248对HL-60细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，将其浓度调整为1.0× 105ml-1，分别与终浓度为 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/ml的 SU11248 共培养，以未处理的HL-60细胞为对照，分别接种于96孔板，每孔200 μl，每组设 4 个平行孔，置 37℃、5%CO2饱和湿度条件下进行细胞培养，分别于24、48、72、96小时加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl/孔，继续培养4小时后离心去上清，加入终止液DMSO溶液150 μl/孔，振荡10分钟，在酶标仪上用双波长492 nm和630 nm测定吸光值(OD值)。计算各时间点的细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%，实验重复3次，取均值。

1.2.3 AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡 收集对照组和 0.25、2.0、4.0 μg/ml SU11248作用48小时 后的HL-60细胞，1/15 mol/L PBS洗涤2次。使用1×binding buffer调整细胞浓度为5×105ml-1。吸取100 μl细胞到 1.5 ml EP 管，加入 5 μl AnnexinV-FITC 和 5 μl PI。室温下(20℃ ～25℃)避光轻摇孵育15分钟后，再加入400 μl 1×binding buffer。1小时内避光送流式细胞室检测。实验重复3次。

1.2.4 DNA倍体分析及细胞周期分析 收集对照组和2.0 μg/ml SU11248 作用 24、48、72 小时后的HL-60细胞，用 1/15mol/L PBS洗涤细胞 1次(2 000 r/min离心，5分钟)收集并调整细胞浓度为1×106ml-1，用70%乙醇固定后PBS洗去固定液，加入200 μl RNase A 37℃水浴30分钟，再加入800 μl PI染色混匀，4℃避光30分钟，冰浴，避光送流式细胞室检测。实验重复3次。

1.2.5 细胞DNA片段化检测 收集对照组和0.25、2.0、4.0 μg/ml SU11248 作用 48 小时 后的HL-60细胞，1/15 mol/L PBS洗涤细胞2次，加入50 μl细胞裂解缓冲液(Tris-HCl 10 mmol/L，pH7.6;NaCl 100 mmol/L;EDTA 10 mmol/L)，作用16秒，6 600 r/min，离心5分钟，吸上清于 EP管。加入SDS，调整终浓度为1%，加入RNase A，调整终浓度为1 μg/μl，56℃水溶 2 小时。加入蛋白酶 K，调整终浓度 为2.5 μg/μl，37℃水浴 2小时。加入1/10体积10 mmol/L乙酰胺和2.5体积无水乙醇沉淀DNA，-20℃过夜。12 000 r/min离心5分钟去上清，沉淀吹干后溶于TE溶液。提取的DNA经1.5%琼脂糖凝胶(含0.1%EB)电泳，35 V，3小时，紫外灯下观察结果。

1.2.6 Western blot检测 bcl-2、bax、caspase-3 蛋白水平的变化 以IC50(2.0 μg/ml)的SU11248作用HL-60细胞后，于24、48、72小时分别提取蛋白，进行Western blot检测，简述如下:

收集对照组和2.0 μg/ml SU11248 作用24、48、72小时后的HL-60细胞，每组约5×106ml-1个，离心弃上清，沉淀用1/15 mol/L PBS洗涤2次，去上清(洗涤液要吸干净)。按1×106细胞/100 μl裂解液+1 μl蛋白酶抑制剂的比例裂解细胞。提取细胞总蛋白。Bradford法(考马斯亮蓝法)，测定蛋白质含量。

20 μg总蛋白进行120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电转移至NC膜上，用50 g/L脱脂奶粉封闭1小时。根据蛋白Marker将膜在适当位置剪开，做好标记，分别与相应的一抗(bcl-2鼠抗人抗体，bax鼠抗人抗体，caspase-3鼠抗人抗体)反应过夜。再与相应二抗(1∶2 000羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG)室温下反应，ECL免疫印迹化学发光试剂放射自显影，应用计算机图像扫描分析系统对图像进行扫描分析，以目的条带与内参照β-actin的灰度值之比作为目的条带蛋白的相对表达量，实验重复4次。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件对所有数据进行统计学分析，多组间均数比较采用方差分析，两组间比较用 t检验，实验结果用x±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SU11248对HL-60细胞增殖的影响

2.1.1 SU11248对HL-60细胞增殖抑制作用量效关系 不同浓度SU11248作用HL-60细胞48小时后，各实验组SU11248对HL-60细胞均有抑制作用，细胞增殖反应(OD值)与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)，并随药物浓度的增加抑制率显著增高(见表1)。

2.1.2 SU11248对HL-60细胞增殖抑制作用时效关系 2.00 μg/ml SU11248作用 HL-60细胞 24、48、72、96小时后，细胞增殖反应(OD值)均较对照组明显降低，P＜0.05(见表2)，在72小时抑制率达到最高。

2.2 AnnexinV/PI双染流式细胞术检测SU11248对HL-60细胞凋亡影响 对照组、0.25、2.00、4.00 μg/ml SU11248作用HL-60细胞48小时后凋亡率分别为1.30%、4.80%、40.89%、43.71%，药物组较对照组明显增高(P＜0.05)且随药物作用浓度的增高凋亡率增高(见图1)。2.3 SU11248对HL-60细胞DNA倍体影响 2.00 μg/ml SU11248作用于HL-60细胞后，G0/G1期细胞比例较对照组(29.51%)高(P＜0.05)，且随时间增加而明显增加，24、48、72小时G0/G1期细胞比例分别为47.91%、54.15%、62.41%，而G2期及S期细胞比例均下降，而且在各处理组均可见亚二倍体G1峰(凋亡峰)，如图2A～D所示。与对照组相比，细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)。

表1 不同浓度SU11248对HL-60细胞生长的影响Tab．1 Effects of SU11248 with different concentration on cell growth of HL-60 cells

表2 SU11248(2．0 μg/ml)对HL-60细胞在不同时间生长的影响Tab．2 Effects of SU11248 on cell growth of HL-60 cells at different time points

图1 AnnexinV/PI双染流式细胞术检测不同浓度SU11248作用HL-60细胞凋亡率(48小时)Fig．1 Effect of SU11248 on the rate of apoptosis of HL-60 cells detected by flow cytometer with AnnexinV/PI double-stain(48 h)

图2 DNA倍体分析检测SU11248作用HL-60细胞不同时间后细胞凋亡率Fig．2 Effect of SU11248 on apopotosis induction in HL-60 cells at different time points with analyzing DNA ploidy

表3 SU11248作用HL-60细胞后bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达水平的变化(与内参β-actin蛋白的比值)Tab．3 Expression of bcl-2，bax，caspase-3 protein of HL-60 cells treated with 2．0 μg/ml SU11248 at different time points(compared with β-actin)

图3 不同浓度SU11248作用HL-60细胞48小时后DNA Ladder凝胶电泳图Fig．3 Effect of SU11248 on DNA fragmentation in HL-60 cells with different concentration

图4 Western blot检测2．0 μg/ml SU11248 作用 HL-60 细胞后不同时间 β-actin、bcl-2、bax、caspase-3蛋白的表达情况Fig．4 Expression of β-actin，bcl-2，bax，caspase-3 protein in HL-60 cells treated with 2．0 μg/ml SU11248 at different time points

2.4 SU11248对HL-60细胞DNA片段化形成影响琼脂糖凝胶电泳显示SU11248作用HL-60细胞48小时后，2.0和4.0 μg/ml处理组出现明显凋亡特征的DNA改变，即呈典型的DNA降解“梯状”条带片段，而在0.25 μg/ml处理组没有出现明显的梯带(Ladder)，对照组细胞基因组DNA完整，见图3。

2.5 Western blot检测SU11248干预HL-60细胞前后bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达水平变化 2.0 μg/ml SU11248作用24、48、72 小时后，ECL 荧光显色实验中采用β-actin蛋白为内参照以保持蛋白上样量的一致性。Western blot结果显示SU11248作用后bcl-2蛋白水平较对照组低，且随药物作用时间的延长，蛋白表达逐渐减弱(P＜0.05)，而SU11248作用后caspase-3蛋白水平较对照组升高，随药物作用时间的延长表达逐渐增强(P＜0.05)，bax蛋白水平则不发生明显变化(P＞0.05)，见表3及图4。

3 讨论

SU11248是一种口服的小分子药物，能够抑制VEGF-R2、-R3和-R1以及血小板衍生生长因子(PDGFR-β)、KIT、FLT-3 和 RET 的酪氨酸激酶活性，通过特异性阻断这些信号传导途径达到抗肿瘤效应［4，5］。SU11248的抗肿瘤活性已经在各种晚期恶性肿瘤患者中得到证实，包括肾细胞癌、肉瘤、乳腺癌等［6-9］。由于近年来在治疗对格列卫无效的肠胃道肿瘤方面显示了较好的临床疗效，SU11248更加受到了人们的关注，在实体瘤方面已有较多的研究，并取得一定的临床效果，但在国内外，有关其抗白血病方面的研究鲜见报道，国外有初步实验表明，SU11248可以诱导白血病细胞凋亡从而使急性髓细胞样白血病病人部分缓解［3］。本实验首先通过MTT比色法观察正常状态下HL-60细胞的生长特点以及不同浓度SU11248(0.25～8.0 μg/ml)作用HL-60细胞的生长、增殖的改变。研究结果显示:SU11248对HL-60细胞株具有较强的抑制增殖作用，而且这种抑制作用呈明显的量效和时效关系。HL-60细胞与不同浓度SU11248共育时，细胞生长明显受到抑制，IC50约为2.0 μg/ml。DNA有规律地在核小体之间降解形成梯状带，是凋亡细胞的重要生化标志。本实验琼脂糖凝胶电泳显示，SU11248能诱导HL-60细胞出现典型的DNA梯状带。AnnexinV/PI双染流式细胞术检测HL-60细胞凋亡表明SU11248作用的剂量依赖性，随着作用浓度的升高HL-60细胞凋亡率也随之增加。DNA倍体分析表明SU11248可诱导HL-60细胞出现典型的亚二倍体峰(凋亡峰)，并且存在明显的时效关系。本研究结果还显示SU11248具有细胞周期阻滞作用，可将HL-60细胞阻滞于G0/G1期，阻止细胞进入S期和G2/M期。G1期阻滞是细胞增殖抑制的重要环节，细胞不能进入S期，DNA合成无法完成，干扰了蛋白质代谢，从而抑制了肿瘤细胞的分裂。以上实验表明，SU11248在体外能抑制HL-60细胞增殖，诱导细胞凋亡，并呈现时间和剂量的依赖性。

为探讨SU11248对白血病细胞抑制增殖、诱导凋亡作用的可能机制，本实验通过Western blot检测SU11248干预HL-60细胞前后凋亡信号通路分子bcl-2、bax、caspase-3蛋白表达水平的变化。

研究结果显示在SU11248抑制HL-60细胞增殖、诱导细胞凋亡过程中bcl-2基因较对照组低且随着作用时间的延长而逐渐下调，bax基因无明显变化。提示SU11248可能是通过调节bcl-2家族蛋白中bcl-2蛋白的表达改变抗凋亡分子和促凋亡分子之间的比率最终实现对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。Caspase级联反应被认为是细胞程序性死亡的执行阶段，且该反应可被抗凋亡bcl-2家族蛋白分子所拮抗［10］。在探讨了SU11248对白血病细胞HL-60中bcl-2家族蛋白bcl-2的调节作用后，本研究进一步考察了SU11248对HL-60细胞中caspase-3的影响。Western blot结果表明，SU11248可以通过促进caspase-3的裂解而激活caspase级联反应，最终实现对HL-60细胞的凋亡诱导作用。

上述研究结果提示:SU11248作用于人白血病细胞后可以通过诱导bcl-2家族蛋白的改变而促发线粒体释放细胞色素C，随后通过裂解caspase-3而激活caspase级联反应，最终完成了对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。总之，调节bcl-2家族蛋白之间的平衡并激发caspase级联途径从而通过内部途径促进凋亡是SU11248在体外发挥抑制人白血病细胞生长、诱导细胞凋亡的可能机制之一。SU11248是否同时还可通过其他凋亡调控途径发挥抗肿瘤效应及其相应的确切机制，有待进一步的研究。

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