紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡糖苷对免疫效应细胞增殖格局的调节作用①

余晓曦 孟凌华 余奇文 (上海交通大学医学院药学系，上海200025)

CD8+CTL细胞、NK细胞和NKT细胞是一类具有细胞毒作用的免疫效应细胞，在抗肿瘤免疫等方面发挥重要作用。肿瘤过继性细胞免疫治疗是将从个体中分离获取的淋巴细胞经体外刺激，通过调节免疫细胞的数量和功能后，回输人体发挥抗肿瘤作用，其关键是如何在短时间内诱导细胞快速增殖并达到理想的效应细胞组成格局。花青素(Anthocyanidin)又称花色素，基本结构为2-苯基苯并吡喃型阳离子，常与一个或多个葡萄糖形成各种花色苷而广泛存在于蓝莓、葡萄、紫甘薯、黑加仑、胡罗卜、紫苏和红甘蓝等植物中，发挥抗氧化作用［1］。花青素具有增强免疫功能、抑制肿瘤细胞生长、保护肝脏以及有效减轻由氧化应激引起的神经细胞损伤等作用［2，3］。我们从紫苏叶中提取花青素的有效成分紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷，刺激诱导人外周血单个核细胞，观察 CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞以及NKT细胞等免疫效应细胞增殖格局的变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 湖北紫苏叶，由本院药化教研组提供;人参皂苷Rh2，上海源叶生物科技有限公司产品;荧光标记抗体:CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-APC cocktail、CD56-FITC、Va24-Ja18-TCR-PE，eBioscience产品;RPMI1640培养液，Gibco产品;LymphoprepTM(1.077 ±0.001)g/ml，Norway产品;rIL-2，上海华新生物制品公司产品;rINF-γ，Quantikine产品;抗人CD3单克隆抗体，由上海市免疫学研究所提供;人AB型血清，由上海市血液中心提供。

1.2 主要仪器 制备型HPLC(Agilent1200);分析型HPLC(Agilent1100);FACS-Calibur流式细胞仪(BD公司)。

1.3 紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷分离提取取湖北省野生半红紫苏叶82.3 g，以50 mmol/L硫酸-50%甲醇溶液于室温下低速搅拌浸泡，浸出物用等体积乙酸乙酯作液液萃取，水相萃取物以配备Kromasil C18 柱(粒径5 μm，21.2 ×250 mm)的 Agilent1200制备型液相色谱进行分离，流动相A为2%甲酸/水、B为甲醇，流速10 ml/min，甲醇比例在50分钟内由40%增至70%梯度洗脱。

1.4 紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷鉴定 分离产物经Agilent1100 HPLC分析，采用Kromasil C18柱(粒径5 μm，4.6 ×250 mm)，VWD 可变波长检测器，检测波长分别为325 nm和530 nm，流动相A为4%甲酸/水，B为4%甲酸/乙腈，流动相A在0到60分钟内由94%变化到78%，流速0.8 ml/min。

1.5 细胞刺激培养 取2支抗CD3单克隆抗体，以20 ml生理盐水溶解制成包被液，0.22 μm过滤器除菌，然后加至48孔细胞培养板孔内，每孔400 μl，置4℃冰箱过夜，次日弃去包被液备用。取正常人肝素抗凝静脉血，用培养液对倍稀释，用 LymphoprepTM，2 000 r/min，20 分钟分离单个核细胞，用培养液洗涤细胞3次，计数细胞，并以含有10%AB型人血清、1 000 U/ml IL-2、1 000 U/ml IFN-γ 的RPMI1640培养液调节细胞浓度为5×105ml-1，加入到包被有CD3单克隆抗体的细胞培养板中，每孔600 μl，3复孔。分别设置实验组和对照组，实验组刺激物分别为紫苏宁、矢车菊素3，5-二葡萄糖苷、紫苏宁+矢车菊素3，5-二葡萄糖苷、PHA、人参Rh2等。PHA为1%、0.1%和0.01%3种浓度，其他刺激物均为 100、10、1.0 μg/ml 3 种浓度。37℃，5%CO2培养箱内培养，每3天换半液，于第4、7天取细胞进行荧光抗体染色，FACS检测。

1.6 流式细胞术检测细胞表型 取1×105个培养细胞，用1%FBS-PBS洗涤，洗涤后细胞悬浮于100 μl 1%FBS-PBS，加入荧光抗体，室温避光培养30分钟，洗3次，上FACS仪检测CD3+T细胞数、CD4+T细胞数、CD8+T细胞数、NK细胞数以及NKT细胞数。

1.7 统计学分析 组间样本采用t检验，结果用x±s表示，P＜0.05表示具有统计学差异。

2 结果

2.1 紫苏宁和矢车菊3，5-二葡萄糖苷提取与鉴定结果 从82.30 g紫苏叶中分离提取得到0.33 g紫苏宁和0.35 g矢车菊素3，5-二葡萄糖苷，经鉴定与国外实验HPLC峰谱一致［4］。从图1可见紫苏宁(A1)在波长325 nm和530 nm下几乎无杂质峰，达到了较高的纯度，在近52分钟时形成波峰;矢车菊素3，5-二葡萄糖苷(A2)在波长325 nm和530 nm下有少量杂质峰，在18分钟附近形成波峰。

2.2 不同浓度紫苏宁和矢车菊3，5-二葡萄糖苷对免疫效应细胞的刺激 以①100 μg/ml、②10 μg/ml、③1.0 μg/ml 3 种浓度的紫苏宁、矢车菊素 3，5-二葡萄糖苷、紫苏宁+矢车菊素3，5-二葡萄糖苷刺激正常人外周淋巴细胞，刺激7天以后免疫效应细胞组成格局变化见表1。

图1 紫苏宁(A1)和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷(A2)HPLC鉴定图谱Fig．1 Identification of Shisonin(A1)and Cyanidin(A2)with HPLC

2.3 紫苏宁和矢车菊3，5-二葡萄糖苷与PHA和人参皂苷Rh2刺激比较 以紫苏宁、矢车菊素3，5-二葡萄糖苷、紫苏宁+矢车菊素3，5-二葡萄糖苷以及人参Rh2浓度均为10 μg/ml，PHA浓度为1%，经4天刺激诱导正常人外周淋巴细胞以后免疫效应细胞组成格局变化见表2。矢车菊素3，5-二葡萄糖苷对CD8+T和NK细胞增殖具有显著上调作用(P＜0.05);PHA对CD8+、NK细胞和NKT细胞增殖具有显著上调作用(P＜0.01～0.05);人参Rh2对NKT细胞增殖具有显著上调作用(P＜0.01)。

表1 不同浓度的紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷对免疫效应细胞增殖格局的作用(%，x±s)Tab．1 Change of immunologic effector cells stimulated by different concentrations of Shisonin and Cyanidin(%，x±s)

表2 不同刺激物对免疫效应细胞格局的作用比较(%，x±s)Tab．2 Effect of different stimulus to the pattern of immunologic effector cells(%，x±s)

2.4 紫苏宁和矢车菊3，5-二葡萄糖苷等刺激不同时间后结果比较 以紫苏宁、矢车菊素3，5-二葡萄糖苷、紫苏宁+矢车菊素3，5-二葡萄糖苷、PHA和人参Rh2等刺激淋巴细胞诱导培养4天与7天，比较各刺激物对免疫效应细胞的持续刺激效应。紫苏宁对CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞的刺激后细胞增殖百分率自第4天到第7天分别为:49.81±4.42(%)到62.75±5.24(%);25.55±1.56(%)到70.32±5.15(%);0.38±0.12(%)到1.51±0.22(%)，均呈上升趋势(P＜0.05)。矢车菊素3，5-二葡萄糖苷对CD8+T细胞刺激后细胞增殖百分率自第4天到第7天为38.51±2.34(%)到63.03±4.42(%)，呈上升趋势(P＜0.01)。PHA和人参Rh2在第4天到第7天未见持续性刺激效应。

3 讨论

在肿瘤过继性细胞免疫治疗中，需要回输大量具有杀肿瘤效应的淋巴细胞。为了快速、经济地诱导免疫效应细胞增殖，本实验以紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷刺激正常人外周单个核细胞，刺激培养4、7天以后观察其T细胞亚群、NK细胞以及NKT细胞的刺激增殖作用，结果显示紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷对CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖作用呈现随刺激物浓度升高而增强的趋势，矢车菊素3，5-二葡萄糖苷对NK细胞具有刺激生长作用，而紫苏宁与矢车菊素3，5-二葡萄糖苷等比例混合没有发挥互补的刺激作用，初步证实了紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷具有诱导CD3+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞增殖的作用。体外细胞培养时间延长会导致其活力下降，紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷可以抵抗自由基对脂肪、蛋白质和核酸的氧化性损害，实验显示紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷对细胞的刺激增殖作用随时间延长而更显见。但是紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷在免疫细胞培养中的作用是刺激细胞增长还是抗氧化保护或兼而有之尚待进一步证实。

PHA是人T淋巴细胞非特异性促有丝分裂原，可用于制备CD3AK细胞［5］。本实验发现，单个核细胞经1%PHA刺激4天后，NK细胞和NKT细胞的增殖率明显高于对照组，7天以后，CD3+T细胞和CD4+T细胞数逐渐降低。说明PHA在短期内可以刺激细胞生长，尤其是NK细胞和NKT细胞，长期刺激对CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的效果却逊于紫苏宁和矢车菊素3，5-二葡萄糖苷。人参皂苷Rh2具有诱导肿瘤细胞的逆转和调节免疫功能的作用［6-8］。以Rh2作为刺激物，对单个核细胞4天诱导培养后可以明显刺激NKT细胞增殖(P＜0.01)，7天则可以刺激CD4+细胞和CD8+细胞增殖。2个时间段未见对NK细胞有诱导作用。NKT细胞是一种特定的异质性T细胞亚群，兼有NK细胞和T细胞的某些特征。NKT细胞在发挥杀伤作用时不受MHC限制，激活的NKT细胞可以释放大量细胞因子，增强机体抗感染和抗肿瘤的作用［9，10］。本文初步证明人参皂苷Rh2对CD8+T细胞和NKT细胞具有增殖效应。以花青素、PHA、人参Rh2组合取代细胞因子诱导免疫效应细胞不仅有效且更经济，具有良好的应用前景。

过继性细胞免疫治疗还须考虑Treg细胞、γδT细胞、DC细胞甚至B淋巴细胞在抗肿瘤过程中所扮演的角色［11，12］，探究紫苏宁、矢车菊素 3，5-二葡萄糖苷对上述细胞的作用同样具有实用意义。

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