IL-2协同抗CD45RB抗体调节Treg/Th17细胞的比例并延长小鼠移植皮肤存活时间①

郭伟坚 简优强 张国超 邓春艳 齐 晖 李富荣 周汉新

(暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院临床研究中心，深圳518020)

抗CD45RB抗体是一种新型的免疫耐受诱导剂，可以通过上调CD45RBloT细胞和下调CD45RBhiT细胞的比例来延长移植物的存活时间，抑制排斥反应的发生［1］。在小鼠肾、胰岛和心脏移植应用抗体治疗都可以成功地延长移植物的存活时间并诱导产生稳定的免疫耐受［2-4］。在免疫耐受诱导过程中，调节性T细胞(regulator T cell，Treg)与Th17细胞是一组作用相反的T细胞亚群，其中Treg细胞可以促进免疫耐受的形成，而Th17细胞则会阻碍耐受的产生［5］。本课题组已证实了抗CD45RB抗体可以通过上调调节性CD4+CD25+CD127-T细胞百分率和增加Foxp3mRNA表达量来诱导小鼠心脏移植免疫耐受［6］，然而该抗体对Th17细胞的分化有何影响尚未清楚。在免疫耐受形成过程中，IL-2参与诱导初始CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+T细胞并表达Foxp3，使其具备调节性 T细胞的特性［7］。此外，IL-2是Th17细胞分化的抑制因素，它通过STAT5信号传导对Th17细胞的分化起到抑制作用［8］。本研究通过体外及体内实验探讨IL-2在抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中对Treg/Th17细胞的分化有何影响，并进一步阐明抗CD45RB抗体诱导免疫耐受的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性8周龄C57BL/6和BALB/c小鼠，体重20～25克，购自南方医科大学实验动物中心(许可证号:SCXK(粤)2006-0015)，饲养在SPF级动物实验室(暨南大学第二临床医学院实验动物中心)，所有动物实验经过当地伦理委员会批准，对动物处置方法符合动物伦理学要求。

1.1.2 试剂及器材 抗小鼠CD45RB抗体(美国BioXcell);小鼠IL-2(美国Peprotech公司);淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司);抗小鼠CD4-PEcy5、IL-17A-FITC、Foxp3-PE 及相应同型对照(eBioscience);佛波酯(Phorbol 12-Myristate 13 Acatate，PMA)、离子霉素及布雷菲德菌素A(Brefeldin-A，BFA)(美国Sigma公司);流式细胞仪(EPICS ALTRA，美国贝克曼库尔特公司);小鼠CD4+T细胞阴性分选磁珠(德国美天旎)。

1.2 方法

1.2.1 初始CD4+T细胞的分选及鉴定 处死8周龄雄性C57BL/6小鼠，无菌取脾制成单细胞悬液，利用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。用免疫磁珠阴性分选其中的CD4+T细胞，每1×107个细胞用40 μl缓冲液(pH=7.2)重悬，每1×107个细胞先加入 10 μl Biotin-Antibody Cocktail混匀，4℃孵育10分钟;然后加入 20 μl Anti-Biotin MicroBeads混匀，4℃孵育15分钟，洗涤后用500 μl缓冲液重悬，并用分选柱通过磁珠分离器分选CD4+T细胞，分选出的CD4+T细胞经细胞免疫荧光染色，流式细胞仪检测细胞纯度＞90%。

1.2.2 IL-2和抗CD45RB抗体与CD4+T细胞共培养对Treg/Th17分化的影响向24孔板中每孔加入CD4+T细胞 1×106个，将实验分为4个组:①CD4+T;②CD4+T+抗CD45RB抗体;③CD4+T+IL-2;④CD4+T+抗 CD45RB抗体 +IL-2，然后用10%FBS RPMI1640每孔定容至1 ml，其中加入抗CD45RB 抗体 为20 μg/ml、IL-2 为100 U/ml。37℃5%CO2培养72小时。每组设3个复孔。培养72小时后取细胞作流式免疫荧光染色，流式细胞仪检测Treg/Th17细胞百分率。

1.2.3 IL-2和抗CD45RB抗体对小鼠皮肤移植生存期的影响 取8周龄雄性BALB/c小鼠为供体，8周龄雄性C57BL/6小鼠为受体，进行同种异基因小鼠皮肤移植。在供体鼠胸背部取1×1 cm的皮肤，去筋膜后移植至受体鼠胸背部，用5-0尼龙丝线缝合10～12针，术后用红霉素眼膏+创口贴包扎，第7天打开包扎观察皮肤存活情况。术后根据不同治疗方案分为3个组，每组20只移植鼠。对照组:腹腔注射生理盐水100 μl;抗CD45RB抗体组:在术后0、2、4、6、8 天给予腹腔注射抗 CD45RB 抗体100 μg/天;抗CD45RB抗体+IL-2组:在抗体CD45RB抗体治疗同时，在术后0、1、2天给予腹腔注射IL-2 2 μg/天。术后小鼠苏醒后单笼饲养，每日观察活动情况及皮肤移植物的存活状况，记录皮肤排斥坏死时间。

1.2.4 Th17/Treg细胞检测 取上述共培养后72小时后的各组CD4+T细胞重悬;皮肤移植在术后第1、3、5、7、9 天，每组各处死 3 只小鼠取脾脏，制成脾细胞悬液。调整细胞浓度为1×106个/ml，取100 μl细胞悬液分别加入 50 ng/ml PMA、1 μg/ml离子霉素、10 μg/ml BFA37℃ 刺激 6 小时。加入 1.5 μl CD4-PEcy5抗体，避光孵育15分钟后，加入破膜/固定工作液对细胞固定和破膜，再加入抗IL-17A-FITC抗体和抗Foxp3-PE抗体各1.5 μl，染色30分钟后清洗，流式细胞仪分析Treg和Th17细胞百分率。

1.3 统计学分析 统计处理采用SPSS13.0软件，各组皮肤移植小鼠的皮肤移植物存活率及生存曲线用log-rank检验。所有数据用x±s表示，两组均数间的比较采用独立样本的t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-2对抗CD45RB抗体诱导Treg/Th17细胞分化的影响 收集培养72小时后各组CD4+T细胞三色法染色后流式细胞仪检测各组中CD4+FoxP3+Treg和 CD4+IL-17+Th17细胞的阳性率。抗CD45RB抗体作用于CD4+T细胞后可以促进其向Treg细胞分化(11.53±0.57)%，抑制其向Th17细胞分化(3.13±0.32)%(图1，P ＜0.05);在 IL-2共同作用下，增强向 Treg细胞分化作用(14.20±0.50)%，并抑制向Th17细胞分化作用(2.23±0.15)%(图1，P ＜0.05)。

2.2 受体鼠皮肤移植存活期的观察 移植术后小鼠在不给予抗体治疗的对照组小鼠皮肤移植物只能存活10天左右;使用抗CD45RB抗体治疗可以延长存活期至20天;抗CD45RB抗体与IL-2联合治疗，可显著延长存活期至25天(图2)。

2.3 受体鼠移植皮肤的病理学变化 在移植后第9天，取各组皮肤移植物作病理切片，观察移植皮肤的炎性细胞浸润情况，正常小鼠皮肤无炎性细胞浸润(图3A);对照组移植皮肤具有严重的细胞，炎症细胞浸润皮肤全层(图3B);抗CD45RB抗体组有轻度的炎性细胞浸润(图3C);抗CD45RB抗体+IL-2组只有少量炎性细胞浸润(图3D)。各治疗组小鼠移植皮肤虽然有炎症细胞浸润，但仅限于筋膜层，真皮层浸润并不严重。

2.4 受体鼠体内Treg和Th17细胞的动态变化对皮肤移植小鼠，在术后第1、3、5、7、9天取脾细胞，观察Treg细胞和Th17细胞的动态变化。对Treg细胞观察，在对照组中没有明显变化，抗CD45RB抗体组随时间明显上升，抗CD45RB抗体+IL-2组上升最快最明显，较对照组和抗CD45RB抗体组明显升高(图4)。在Th17细胞观察中，对照组升高最快最明显，抗CD45RB抗体组呈中度升高，抗CD45RB抗体+IL-2组只有轻度升高(图5)。

图1 体外各组CD4+T细胞培养72小时后Treg/Th17细胞所占的比例Fig．1 The percentage of Treg/Th17 cells in cultured CD4+T cells detected by FCM in vitro

图2 移植皮肤生存曲线Fig．2 Survival curves of skin graft

图3 各组皮肤移植小鼠术后第9天移植皮肤的病理切片Fig．3 Histology of BALB/c mouse skin allografts on day 9 after transplantation

图4 体内Treg细胞动态变化Fig．4 Dynamic changes of Treg cells in vivo

图5 体内Treg细胞动态变化Fig．5 Dynamic changes of Th17 cells in vivo

3 讨论

大量的动物实验证明，抗CD45RB抗体可以成功诱导免疫耐受并能逆转排斥反应。抗CD45RB抗体诱导免疫耐受可通过多种途径发挥作用，它可以通过上调CTLA-4分子向T细胞释放负向调节信号［9-11］;在诱导免疫耐受过程中需要完整的胸腺，并通过胸腺产生供体特异性Treg细胞诱导免疫耐受，在缺失胸腺的情况下虽然在外周免疫系统中依然有免疫抑制的活性，但并不能够诱导免疫耐受的形成［12］;在诱导免疫耐受时需要宿主B淋巴细胞的参与，并且通过B细胞与T细胞的相互作用诱导免疫耐受［13］;通过有效抑制成熟树突状细胞(Dendritic cells，DCs)的功能和产生耐受型DCs诱导免疫耐受的形成［14］。此外，抗体还可以清除引起免疫排斥反应的CD45RBhiT细胞，使CD45RBloT细胞富集，从而调节CD45RBloT细胞与CD45RBhiT细胞的比例，抑制排斥反应的发生，延长移植物的存活时间甚至诱导产生稳定的特异性免疫耐受［15］。

在免疫耐受形成过程中，Treg细胞发挥着举足轻重的作用，多种诱导免疫耐受方案是通过各种免疫耐受诱导剂促使T细胞向FoxP3+Treg细胞分化从而产生稳定的免疫耐受［16］。外周免疫系统中的初始CD4+T细胞在TGF-β和IL-2的共同作用下可以向Treg分化，并通过分泌TGF-β和IL-10发挥着免疫调节的作用来诱导免疫耐受［17］。近年来研究发现，免疫系统中存在着一种功能与Treg细胞相反的Th细胞亚群，这种Th细胞以分泌IL-17为特征，称为Th17细胞，参与自身免疫性疾病及免疫排斥反应的发生。活化后的初始CD4+T细胞在TGF-β和IL-6的共同作用下可以向Th17分化，并通过分泌IL-17来介导炎性反应，抑制免疫耐受的产生［5］。Treg与Th17细胞作为一组作用相反的T细胞亚群，它们共同由初始CD4+T细胞分化而来，Treg/Th17细胞在体内谁占上峰发挥主导作用，决定免疫耐受或免疫排斥反应的发生程度［5］。在本研究中，抗CD45RB抗体与CD4+T细胞共培养，抗CD45RB抗体具有促进CD4+T细胞向Treg细胞分化，抑制向Th17细胞分化作用。在同种异体皮肤移植模型中，抗CD45RB抗体的治疗，使移植物存活期明显延长，同时Treg细胞数量较对照组逐渐明显升高，Th17细胞数量呈下降。上调Treg细胞和抑制Th17细胞数量可能是抗CD45RB抗体诱导免疫耐受的主要机制之一。

IL-2是一种T细胞生长因子，主要由活化状态下的效应T细胞分泌，在Treg的分化、发育过程中发挥着很重要的作用，它通过与IL-2R结合进行信号传导，从而增加未成熟Treg表达Foxp3和CD25，并促进其向成熟 Treg分化［18］。此外，IL-2还可以通过STAT5信号传导途径，下调多种Th17细胞分化相关基因的表达，抑制Th17细胞分化。在我们的实验中发现，IL-2与抗CD45RB抗体共同作用下，可增强抗CD45RB抗体促进CD4+T细胞向Treg细胞分化作用，也增强抗CD45RB抗体抑制其向Th17细胞分化作用。在同种异体皮肤移植小鼠中，用IL-2联合抗CD45RB抗体治疗，较抗CD45RB抗体单独治疗，生存期明显延长，移植皮肤中炎症细胞的浸润明显减少。我们的前期研究发现，抗CD45RB抗体并不能直接作用于Treg细胞使其扩增，但它可以使低表达CD45RB分子的Treg细胞富集。由于IL-2具有促进Treg细胞分化并抑制Th17细胞分化的作用，与抗 CD45RB抗体联合应用后可增强抗CD45RB抗体对Treg/Th17细胞的调节作用，提示IL-2具有协同抗CD45RB抗体的作用，延缓排斥反应的发生，延长移植皮肤的存活时间。

综上所述，抗CD45RB抗体在诱导免疫耐受中，具有上调Treg细胞和抑制Th17细胞的作用，IL-2可以增强抗CD45RB抗体的作用，延缓小鼠同种异基因皮肤移植排斥反应的发生，延长移植物的存活时间。因此，在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受时联合应用IL-2治疗可以更有效地诱导免疫耐受，为免疫耐受的诱导提供新的治疗策略。

1 Luke P P W，Deng J P，Lian D et al.Prolongation of allograft survival by administration of anti-CD45RB monoclonal antibody is due to alteration of CD45RBhi:CD45RBlo T-cell proportions［J］.American J Transplan，2006;6(9):2023-2034.

2 Lazarovits A I，Poppema S，Zhang Z et al.Prevention and reversal of renal allograft rejection by antibody against CD45RB ［J］.Nature，1996;380(6576):717-720.

3 Basadonna G P，Auersvald L，Khuong C Q et al.Antibody-mediated targeting of CD45 isoforms:a novel immunotherapeutic strategy［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1998;95(7):3821-3826.

4 Sho M，Harada H，Rothstein D M et al.CD45RB-targeting strategies for promoting long-term allograft survival and preventing chronic allograft vasculopathy1 ［J］.Transplantation，2003;75(8):1142-1146.

5 Littman D R，Rudensky A Y.Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation ［J］.Cell，2010;140(6):845-858.

6 汪向飞，张晓丹，邓春艳 et al.CD4+CD25+CD127-T细胞在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中的作用［J］.中国免疫学杂志，2010;26(06):523-527.

7 Zheng S G，Wang J，Wang P et al.IL-2 is essential for TGF-β to convert naive CD4+CD25 cells to CD25+Foxp3+regulatory T cells and for expansion of these cells［J］.J Immun，2007;178(4):2018-2027.

8 Laurence A，Tato C M，Davidson T S et al.Interleukin-2 signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation ［J］.Immunity，2007;26(3):371-381.

9 Fecteau S，Basadonna G P，Freitas A et al.CTLA-4 up-regulation plays a role in tolerance mediated by CD45 ［J］.Nat Immunol，2001;2(1):58-63.

10 Ariyan C，Salvalaggio P，Fecteau S et al.Cutting edge:transplantation tolerance through enhanced CTLA-4 expression［J］.J Immun，2003;171(11):5673-5677.

11 Jen K Y，Campo M，He H et al.CD45RB ligation inhibits allergic pulmonary inflammation by inducing CTLA4 transcription ［J］.J Immun，2007;179(6):4212-4218.

12 Deng S，Moore D J，Huang X et al.Antibody-induced transplantation tolerance that is dependent on thymus-derived regulatory T cells［J］.J Immunol，2006;176(5):2799-2807.

13 Deng S，Moore D J，Huang X et al.Cutting edge:transplant tolerance induced by anti-CD45RB requires B lymphocytes［J］.J Immunol，2007;178(10):6028-6032.

14 Xia X，Zhang X，Huang X et al.Anti-CD45RB monoclonal antibody induces immunologic toleration by suppressing dendritic cells［J］.Transplant Immunology，2009;21(3):136-139.

15 Luke P P W，Deng J P，O ＇Brien C A et al.Alteration in CD45RBhi/CD45RBlo T-cell ratio following CD45RB monoclonalantibody therapy occurs by selective deletion of CD45RBhi effector cells［J］.Transplantation，2003;76(2):400-409.

16 Langier S，Sade K，Kivity S.Regulatory T cells:the suppressor arm of the immune system ［J］.Autoimmunity Reviews，2010;10(2):112-115.

17 Sakaguchi S，Yamaguchi T，Nomura T et al.Regulatory T cells and immune tolerance［J］.Cell，2008;133(5):775-787.

18 Bayer A L，Yu A，Malek T R.Function of the IL-2R for thymic and peripheral CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells［J］.J Immun，2007;178(7):4062-4071.