安徽产丹参高效液相色谱指纹图谱的研究

张 颖，刘学医，周 宙，赵宝林

安徽产丹参高效液相色谱指纹图谱的研究

张 颖，刘学医，周 宙，赵宝林

摘 要：本研究的目的是建立高效液相色谱法安徽产丹参药材的指纹图谱。所彩的方法采用HPLC法测定，以甲醇5%冰乙酸水溶液为流动相，混合梯度洗脱，检测波长为281nm，柱温25℃，流速0.8ml/min。摸索并建立了安徽丹参HPLC的指纹图谱，图谱中各成分峰峰型良好，分离较完全，各产地丹参药材在该方法下易于对比和分析。本方法稳定可靠，对于丹参的色谱分析具有一定积极意义，可以作为控制丹参内在质量的方法之一，为安徽药用丹参的质量评价提供一定依据。

关键词：丹参；HPLC；指纹图谱

张颖，刘学医/安徽中医药高等专科学校讲师（安徽芜湖241000）；周宙/安徽中医药高等专科学校助教（安徽芜湖241000）；赵宝林/安徽中医药高等专科学校副教授（安徽芜湖241000）。

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参SalviamiltiorrhizaBge的干燥根及根茎，主治瘀血所致的各种疼痛、徵瘕积聚、疮疡痈肿以及心悸失眠等症，丹参主要含脂溶性二萜醌类(丹参酮I、丹参酮Ⅱ和隐丹参酮等)和水溶性酚酸类(丹参素、原儿茶酸、丹酚酸A、B等)等成分，其他还含有原儿茶醛、黄芩苷和谷氨酸等成分[1]。指纹图谱经过数年的发展，已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段。安徽自古盛产优质丹参，是重要丹参的生产基地之一。本实验对安徽不同产地丹参药材进行了HPLC分析测试，摸索并建立了丹参指纹图谱的共有模式，该方法可作为控制丹参内在质量的方法之一，对于全面评价丹参药材质量具有一定的积极意义。

一、材料与方法

（一）仪器和材料

1.仪器与试剂。美国waters E600高效液相色谱仪；waters 2489 UV/Visble Detector；浙江大学N2000色谱工作站；美国waters Symmetry C18色谱柱。上海上平仪器公司分析天平。甲醇、冰乙酸为色谱纯，南京化学试剂厂生产，水为娃哈哈纯净水。对照品丹参素钠（批号110855-200809）、丹酚酸B(批号111562—200807)、丹参酮ⅡA（批号110766-200619）、隐丹参酮(批号0852-9903)、丹参酮I(批号0867-2000003)、二氢丹参酮（批号0868-200002）由中国药品生物制品检定所提供。

2.样品。供试品丹参由安徽中医药高等专科学校中药教研室赵宝林副教授鉴定。

（二） 方法[2]

1.HPLC色谱条件。waters symmetry C18 5μm 4.6 mm×150mm色谱柱。检测波长为281nm，柱温25℃，流速0.8ml/min。流动相为甲醇和5%冰乙酸水溶液混合梯度洗脱，梯度洗脱条件如表1所示。

2.对照品溶液制备。精密称取各对照品，用甲醇配制成丹参素钠溶液100μg/ml、丹参酮I溶液106μg/ml、隐丹参酮溶液106μg/ml、二氢丹参酮溶液 110μg/ml、丹酚酸 B溶液97μg/ml、丹参酮ⅡA溶液99μg/ml。

3.样品溶液制备。取干燥样品0.5g，粉碎后置于100ml圆底烧瓶中，加入50ml甲醇溶液，精密称取其质量后于沸水浴上加热回流提取1h，冷却放至室温，依之前称取的质量补足所失甲醇，用0.45μm微孔滤膜过滤即得待测溶液。

4.测定方法。取各供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪中，记录色谱图并计算。

5.方法学考察。

（1）对照试验。分别吸取丹参素钠、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮I、二氢丹参酮对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

（2）稳定性和精密度试验。取同一份供试品溶液，分别在0.5h、2h、5h、12h、24h后进行分析测试，考察色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间的RSD均小于5%；取同一份供试品溶液，连续进样5次，考察色谱峰保留时间的一致性，各色谱峰保留时间的RSD均小于5%。

二、指纹图谱及各项技术参数

测试丹参药材所得指纹图谱见图1。分析比对8个产地药材供试品溶液HPLC指纹图谱，可确定其中14个峰是所有供试品所共有的，因此确定这14个峰为共有指纹峰，其中峰14为丹参酮ⅡA，设定其为基础峰。8个产地药材供试溶液的共有峰相对保留时间和相对面积见表2和表3。

表1 HPLC梯度洗脱条件

图1 丹参指纹图谱

表2 共有指纹峰的相对保留时间

表3 共有指纹峰的相对峰面积

三、讨论

1.经过多次实验对比，确定采用甲醇作为提取溶剂，水浴加热回流提取1小时，提取范围广，可兼顾水溶性成分和脂溶性成分，提取效率高；建立了丹参药材的指纹图谱方法，所得图谱峰数多且分离度好；采用加入少量乙酸的乙醇水系统梯度洗脱，有效的降低了丹参中酚酸所带来的拖尾现象，经过摸索，确定了洗脱时间和条件，分离效果较好，所得图谱峰型良好，分离度高，易于比较和分析；扫描波长选择为281nm，所得图谱信息量丰富且峰位分布合理。

2.建立的指纹图谱方法实用性强，重现性好，可作为丹参指纹图谱的成熟条件加以应用；使用指纹图谱相似度软件进行计算，结果表明所测试丹参药材之间相似度大于98%，与图谱观察判断一致，说明建立的指纹图谱具有特征性，可为丹参药材的质量控制提供可靠依据，

3.本实验有待进一步测定更多省份和批次的丹参药材进行研究验证，使应用HPLC指纹图谱检定和判断丹参药材质量的方法更加完善和科学。

[1]赵宝林，刘学医，刘宏等.安徽药用丹参资源调查研究[J].现代中药研究与实践，2010，24（5）：31-32

[2]郑晓珂，董三丽，冯卫生等.河南产丹参高效液相色谱指纹图谱的研究[J].中国现代应用药学杂志，2006，23（1）：57-60

中图分类号：Q948

B

1671-6531（2012）10-0037-02

安徽省高校青年教师资助计划项目 （编号：2008jq1171）；安徽高校省级自然科学研究项目 （编号：KJ2008B078）

：何 岩