高效液相色谱法检测玉米及玉米叶中乙草胺的残留量

刘晓明，郭平毅，冯翠萍，，王振

（1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷030801；2.山西农业大学 农学院，山西 太谷030801）

乙草胺，英文通用名为acetochl or，化学名称为2－乙基－6－甲基－N－乙氧基甲基－α－氯代乙酰替苯胺，分子式C14H20Cl NO2，分子量269.8，是一种选择性芽前除草剂［1］，由美国孟山都公司于1971年开发成功，是目前世界上最重要的除草剂品种之一［2］。该除草剂的特点是土壤处理后具有很高的活性，特别是对有机质含量高的土壤更有效［3］，对一年生禾本科杂草、部分阔叶杂草等具有良好的防除效果 ，而对已出苗杂草无效［4］。乙草胺一直被认为具有活性高、低毒、安全、杀草谱广、适用作物宽和成本低廉等特点，是一种低毒的环境友好型农药，但过量、频繁施用，也会造成一定的环境污染，美国环境保护局将乙草胺定为B－2类致癌物，规定在1个月的监测期，在20个监测井的地下水中残留浓度不得超过0.1 g·L－1［5］。

目前，乙草胺和阿特拉津的混合剂是广泛用于玉米田的芽前选择性除草剂，是我国最大的玉米田除草剂品种。目前国内外的研究主要集中在乙草胺的残留检测及其在环境中的降解因素［6～10］，在推荐剂量以上对作物中乙草胺残留分析还缺乏合理的试验依据。本文结合我国的实际情况，以乙草胺为检测对象，以玉米和玉米叶为检测材料，对乙草胺的残留分析方法进行改进并对最终残留量进行测定，为其合理施用及安全评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 小区试验概况

试验地点：山西农业大学农作站

供试药剂：50%乙草胺乳油

供试品种：新农早2号

施药方法：手动喷雾

本试验以6L·hm－2为残留试验剂量。

1.1.2 试剂

色谱纯甲醇、乙腈（美国Burdick﹠Jackson公司）；乙草胺标准品（美国Sigma公司，纯度为97.3%）；田间供施50%乙草胺乳油（山东麒麟农化有限公司）；甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷（均为国产分析纯）。

1.1.3 仪器

Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司）；固相萃取仪（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；固相萃取柱（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；TDL－40B（高速离心机上海安亭科学仪器厂）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DHG－9243BS－Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）

1.2 试验方法

1.2.1 高效液相色谱分析方法

色 谱 条 件：ODS－C18 柱 （250×4.6mm，5 μm）、紫外检测波长225nm、柱温30℃、进样量：10 μL。保留时间：4.546min。

1.2.1.1 流动相配比的筛选

使用乙腈、水作为流动相，流速设为1mL·min－1，流动相乙腈与水的比例选择50∶50、60∶40、70∶30、80∶20，筛选合适的流动相配比。

1.2.1.2 流速的筛选

将流动相配比设为80∶20，调节流动相的流速为0.8mL·min－1，0.9mL·min－1，1.0mL·min－1，1.2mL·min－1，筛选合适的流速。

1.2.2 样品前处理方法

1.2.2.1 固相萃取柱洗脱溶剂的选择

取空白玉米植株6g，加入60mL甲醇，匀浆3 min，超声波提取10min，过滤，残渣再用30mL上述有机溶剂冲洗，合并上清液，40℃浓缩近干，残渣用5mL的正己烷溶解，在溶解液中加入0.03mL 100mg·L－1乙草胺标准溶液后，将其加入Florisil小柱净化，用不同比例的洗脱液洗脱，过膜进行色谱检测，计算乙草胺的回收率，确定最佳洗脱液。

1.2.2.2 玉米叶前处理方法

剪成小段的玉米植株称取6g，分别加入60 mL有机溶剂乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲醇，匀浆3 min，超声波提取10min，过滤，残渣再用30mL上述有机溶剂冲洗，合并上清液，40℃浓缩近干，残渣用5mL的正己烷溶解，柱净化备用。

1.2.2.3 玉米籽粒的前处理方法

称取20g粉碎的玉米样品于具塞三角瓶中，分别加入加60mL乙腈乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲醇，振荡1h，超声波提取15min，提取液经滤纸过滤到蒸馏烧瓶，再加40mL提取剂溶解残渣，超声波提取10min，过滤，用10mL提取液清洗残渣，合并两次提取液和清洗剂于蒸馏烧瓶中，40℃浓缩近干，加5mL正己烷溶解，柱净化备用。净化步骤同1.2.2.1。

1.2.3 乙草胺标准曲线的绘制

乙草胺标准品用甲醇溶解配制成100μg·mL－1的标准母液，再将此标准溶液稀释成1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg·mL－1系列标准溶液，在4℃下保存待用。

1.2.4 残留量的计算

样品的残留量计算公式：

式中：R：样品中乙草胺残留浓度／μg·g－1

Q：乙草胺标准样品浓度／μg·mL－1

S1：样品色谱峰面积

S2：标准样品色谱峰面积

V2：样品定容体积／mL

W：样品称重／g

1.2.5 添加回收率

取空白植株6g，籽粒20g，分别添加0.01、0.1、0.5mg·kg－13个水平，重复3次，按照试验确定的样品提取净化方法和测定方法测定添加回收率。按色谱峰高是空白样品基线噪声高度3倍计算植株和籽粒中最低检测限。

1.2.6 数据处理

实验数据采用Microsoft excel进行分析。

2 结果与分析

2.1 乙草胺液相色谱条件的确定

2.1.1 流动相的选择

由于乙腈的溶解强度较高且黏度小，采用乙腈∶水做流动相。与甲醇∶水流动相相比，乙腈：水系统的流动相柱压低，基线稳定，测定成分与杂质分离效果好。

分别用乙腈∶水50∶50、60∶40、70∶30、80∶20对标样检测，通过色谱图的比较，流动相乙腈∶水＝60∶40时，峰形较好，保留时间适宜。由图1可知，在此流动相下，乙草胺的峰面积最大，所以选择乙腈∶水＝60∶40做流动相。

图1 流动相对峰面积的影响Fig.1 The effect of mobile phase

2.1.2 流速的选择

随着流速的增加，保留时间变小，由图2可知，流速为1.0mL·min－1时，色谱峰峰面积大，占的比例最大，最终流速选择1.0mL·min－1。

图2 流速对峰面积的影响Fig.2 The effect of velocity

2.2 样品前处理方法的确定

2.2.1 提取剂的选择

乙草胺易溶于乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有机溶剂。试验分别用上述溶剂提取植株和玉米中的乙草胺，发现乙腈、乙酸乙酯、丙酮的提取效率好，甲醇的提取率较差。但丙酮提取的油脂较多，与水互溶且溶解的色素较多，干扰杂质多，不便于后续的净化；乙腈溶解的油脂较少，所以确定玉米粒的提取剂为乙腈。玉米植株中含有一定的水分，而乙酸乙酯与水能很好的分层，有利于样品的分离，采用乙酸乙酯为玉米植株的提取剂。

2.2.2 洗脱液的洗脱效果

从图3中可以看出，随着洗脱液中丙酮、乙酸乙酯比例的增加，洗脱下来的乙草胺量增多，当丙酮、乙酸乙酯的量分别达到20%时，乙草胺的回收率均达到96%～98%，符合农药残留的检测要求，但在试验中发现，洗脱液中乙酸乙酯、丙酮量的增加的同时，洗脱下来的色素量也在增加，相同比例下丙酮洗脱下来的色素比乙酸乙酯的多，所以选择正己烷∶乙酸乙酯＝80∶20。

图3 不同洗脱液的洗脱效果Fig.3 Different efficiency of different elution solvent

2.3 乙草胺标准曲线的建立

吸取1.2.3中乙草胺6个系列浓度梯度标准溶液各10μL，由低向高浓度分别进样。以注入的标准溶液质量浓度为横坐标，所测得的峰面积Y为纵坐标，回归作图，得到乙草胺的标准曲线，见图4。乙草胺标准溶液的线性回归方程为：Y＝279986X＋2143.9，R2＝0.9998。

图4 乙草胺标准曲线Fig.4 The standard curve of acetochlor

2.4 添加回收率和最低检出限

取空白植株6g，籽粒20g，分别添加0.01、0.1、0.5mg·kg－13个水平，重复3次，按照试验确定的样品提取净化方法和测定方法测定添加回收率。结果见表1。从表1可知乙草胺在植株中的添加回收率为93.03%～98.24%，变异系数为1.113%～1.629%；玉 米籽粒 添 加 回 收 率为85.47% ～ 90.67%，变 异 系 数 为 1.497% ～2.177%。回收率均大于80%，满足相关农残分析测定要求。按色谱峰高是空白样品基线噪声高度3倍计算，乙草胺在玉米叶和玉米籽粒中的最低检测限为0.009mg·kg－1。

表1 添加回收率试验结果Table 1 Recoveries of Classic from fortified samples（n＝3）

2.5 试验样品的测定

按照本方法对植株和籽粒进行分析，在此仪器条件下成熟期的玉米叶中并未检测出乙草胺，成熟期的玉米籽粒中最终残留量为0.030 51mg·kg－1。

3 结论与讨论

乙草胺在玉米和玉米叶中的残留分析方法。在借鉴国内外有关乙草胺在其它作物中残留分析方法的基础上，结合实际情况进行了改进。对色谱条件、样品提取剂、洗脱液比例等试验条件进行研究和优化，筛选出了最佳的检测条件，所得试验方法满足常规残留分析要求。

（1）高效液相色谱法测定植株叶和籽粒中乙草胺的条件为：流动相乙腈∶水为60∶40，流速1.0 mL·min－1，柱温30℃。

（2）固相萃取柱有浓缩净化提取液的作用，试验中采用的Florisil柱，属于正相萃取柱，丙酮、乙酸乙酯对于Florisil柱都是强洗脱剂，但是在相同比例下丙酮洗脱下的杂质比乙酸乙酯多。用正己烷∶乙酸乙酯作为洗脱液，可以达到净化提取液的目的，明显改善色谱分离，延长色谱柱。

（3）乙草胺易溶于多种有机溶剂，在选择提取剂时，考虑乙草胺所在基质中的干扰成分。试验选择玉米粒经乙腈提取，玉米叶经乙酸乙酯提取，这样降低了淀粉和色素对提取率的影响。乙草胺在玉米和玉米叶中添加回收率分别为85.47%～90.67%和93.03%～98.24%，相对标准偏差为1.497%～2.177%和1.113%～1.629%，满足农残分析检测要求。

（4）收获期的玉米植株中未检测出乙草胺，玉米籽粒中检测到的乙草胺残留量为0.030 51mg·kg－1，美国规定乙草胺在玉米谷物中的最大允许残留限量值为0.05mg·kg－1。日本规定乙草胺在大豆中的MRL值为0.01mg·kg－1。建议在玉米田使用50%的乙草胺乳油不超过6L·hm－2。

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