响应面法优化嗜盐紫色硫细菌283－1培养基

崔小华，杨素萍，姚鹏

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原030006；2.华侨大学 生物工程与技术系，福建 厦门361021；3.山西中医学院 中西医结合临床医学系，山西 太原030024）

紫色硫细菌是不产氧光合细菌中一个特殊的生理类群，属于Proteobacteria门、Gammaproteobacteria纲、Chromatiales目，有 Chromatiaceae和 Ectothiorhodospiraceae两个科［1］。它们大约出现在3.5Ga年前，生活在富含硫化物光照厌氧的环境中，能利用N2、H2S、H2、CO2和 NH3等原始大气成分和太阳能进行不产氧的光能无机自养生长，也能利用有机物作为电子供体进行光能异养或化能异养生长，对其进行深入研究对于探索生命起源和地球进化、自然界碳、氮、硫物质循环和能量转化有重要的理论意义［2～4］。生产实践中，紫色硫细菌因其特殊的生境和生理特点，在废水处理、生产养殖、天然色素等方面有着广阔应用前景，尤其是它们能耐受高浓度的硫化物，在处理含有高浓度硫化物废水中发挥着重要作用［5］。本实验室分离到一株含奥氏酮、耐高浓度硫化物、嗜盐、耐碱紫色硫细菌菌株283－1，该菌株能氧化硫化物产生硫粒储存在细胞内，而且能以亚硝酸盐作为唯一氮源，细胞含有奥氏酮类胡萝卜素和强吸收峰位于830nm处的细菌叶绿素a［6］，对其光合作用元件，耐盐机理和去除碳、氮、磷和有毒物质硫化物进行深入研究对于探索光合作用机理、抗逆机制和耐盐机理和水质净化具有重要的理论意义和应用价值。但该菌株生长速率慢，周期长且菌体的生物量较低，难以满足理论研究和实际应用的要求。因此，本实验选择了响应面设计法，在单因素实验的基础上，通过Plackett－Burman设计筛选出对菌体生物量具有显著影响作用的因子，然后通过最陡爬坡试验，确定接近显著因子最佳响应浓度，最后采用中心组合试验设计筛选显著因子的最优水平，以期得到最优培养基配方提高生物量，为菌株283－1的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

紫色硫细菌 Marichromatiunsp.283－1，Gen－Bank登录号为EU057602，本实验室从青岛盐池卤水中分离、鉴定并保存。

1.2 培养基和培养条件

菌种培养采用Pfennig紫色硫细菌培养基［7］。接种量为3%，培养条件为2500lux，30℃，光照厌氧，静止培养5天。

1.3 生物量的测定

采用比浊法，以660nm吸光度（OD660）表示生物量。取适量培养液用紫外可见分光光度计测定OD660。

1.4 单因素试验

在Pfennig紫色硫细菌培养基中添加乙酸钠，采用单因素优化法，以菌体生物量为指标，优化了乙酸钠，碳酸氢钠、氯化铵、硫化钠、硫酸镁、无机盐6个因子。

1.5 Plackett－Burman试验

在单因素试验基础上，采用2水平设计，对单因素试验选取的6个因素，进行12次试验，筛选显著影响因子。选取的因素、水平和试验设计见表1和表2。

表1 Plackett－Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman

表2 Plackett－Burman试验Table 2 Results of Plackett－Burman design

1.6 最陡爬坡试验

对1.5筛选出的显著因子，根据Plackett－Burman试验结果拟合的一阶模型方程的系数设计最陡爬坡的步长，以坡的最高点作为后续中心组合的中心点。

1.7 响应面分析

由最陡爬坡试验逼近最大响应区域后，采用中心组合设计法对其进行进一步优化。数据用统计分析软件Design－Expert分析，对得到的理论最高点做3次重复验证。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

经过单因素试验，无机盐溶液、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化铵、硫化钠和乙酸钠的含量分别为1mL·L－1、0.5g·L－1、0.75g·L－1、4.5g·L－1、1g·L－1和1.5g·L－1时，培养菌悬液OD660最高，分别为0.68、0.70、0.80、0.80、1.00和1.80。以Pfennig培养基为对照，培养液OD660为0.45。根据单因子优化的结果来设计Packett－Burman试验各因子的水平。

2.2 Plackett－Burman试验

各因子对菌体生物量影响的方差分析见表3。结果表明，6个因子对菌体生物量的影响有所不同，影响顺序为乙酸钠＞硫化钠＞无机盐＞碳酸氢钠＞硫酸镁＞氯化铵，其中乙酸钠（A）和硫化钠（F）在95%置信区间呈显著影响。经过拟合，各因素的效应良好地符合一阶模型方程，Y＝1.25＋0.23A－0.033B＋0.008D＋0.19F－0.014H－0.063J，R2＝0.9407。

表3 因素的效应分析Table 3 Analysisof factors effect

2.3 最陡爬坡试验

根据Plackett－Burman试验选择显著因子进行最陡爬坡试验。A（乙酸钠）和F（硫化钠）的浓度见表4，其他因子对生物量没有显著影响，因此选择2.1单因素试验优化的因子浓度。由表4可知，A和F的最优浓度在第3处理附近，因此选择A（乙酸钠）浓度1.5g·L－1，F（硫化钠）浓度1.0g·L－1作为响应面试验的中心点。

表4 最陡爬坡试验的设计及结果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiment

2.4 中心组合设计和响应面分析

根据爬坡试验得到的中心点，对因子A和F进行中心组合设计试验，为使拟合方程具有旋转性和通用性，中心点重复5次，星号臂长为1.414，见表5。测定结果见表6。利用Design－Expert软件对表6数据分析，获得回归方程Y＝3.28－0.077A ＋0.089F ＋0.10AF －0.34A2－0.30 F2，其中Y为 OD660，R2＝0.9636。回归模型的方差分析见表7，表明该回归模型高度显著（p＜0.0001），失拟项不显著，拟合方程的二次项、一次项和交互项都具有显著差异，表明A和F这两个因子对生物量的影响有交互作用。

表5 中心组合试验的因子和水平Table 5 Factors and levels for central composite experiment

表6 中心组合试验设计及响应值表Table 6 Result and design table ofcentral composite experiment

表7 回归模型方差分析Table 7 ANOVA for the response surface experiment

回归方程绘制的响应曲面见图1，抛物面开口向下，曲面有最大值。拟合方程的极值点，即为A和F的最佳浓度，经偏导求解A和F数值分别为1.45g·L－1和1.05g·L－1，对应理论最大生物量（OD660）为3.28。

图1 响应面立体图Fig.1 Response surface plot

2.5 优化培养基的验证

优化的培养基和初始培养基培养的生长曲线见图2，与初始培养基相比，在优化培养基中，菌体生长没有明显的延滞期，生长速率提高，最大生物量OD660达到3.12，与回归方程预测值（3.28）基本一致，生物量提高了6倍以上。

3 结论与讨论

响应面分析法因试验次数少、周期短，求得的回归方程精确度高，并且可以研究几个因素之间的交互作用，因此是优化培养基组分的一种有效方法。近年来该方法已广泛应用于各种培养基组分以及发酵条件的优化［8～10］。经过单因素试验，Plackett－Burman试验，最陡爬坡试验，中心组合设计和响应面分析，获得了最佳的培养基配方：乙酸钠1.45g·L－1，碳酸氢钠0.75g·L－1，氯化铵4.5g·L－1，硫酸镁0.5g·L－1，硫化钠1.05g·L－1，氯化钙0.19g·L－1，氯化钾0.34g·L－1，氯化钠50g·L－1，VB1220μg·L－1，无机盐溶液1mL·L－1。与初始Pfennig紫色硫细菌培养基［7］相比，潜伏期缩短，生长速率加快，生物量明显提高。因此，基于响应面设计法得到的优化培养基配方准确可靠，为嗜盐紫色硫细菌283－1的理论研究和实际应用奠定了基础。

图2 菌株283－1培养基优化前（a）后（b）的生长比较Fig.2 The growth of strain 283－1compared before and after optimization

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