Satb2和Cbfα1基因在人牙龈成纤维细胞中的表达

吕春旭，陈晓霞，张 瑾，孙钦峰

(山东大学口腔医院牙周科，山东省口腔生物医学重点实验室，山东济南250012)

牙周病是一种慢性感染性疾病，是成年人牙齿丧失的首要原因［1］。牙周治疗的最终目的是实现牙周组织的完全功能性再生，但传统的治疗方法和引导组织再生技术尚不能完全达到该目的。随着组织工程学理论和技术的发展，牙周组织工程的研究也在不断深入，目前其研究热点主要集中在寻找高效的生长因子、理想的种子细胞和具有良好生物相容性的支架材料上［2］。特殊富含AT序列结合蛋白(special AT－rich sequence binding protein，SATB)－2是一种核基质蛋白，在颅面部的发育和成骨细胞的分化中起关键性作用，可通过招募其他转录因子，直接或间接地调控主要骨基因的表达［3－4］。最近研究发现，Satb2 在牙胚中也有表达［5］，提示Satb2在牙及牙周组织发育中起着一定作用。核心结合因子 α1(core binding factor α1，CBFα1)是成骨特异性转录因子和成骨细胞分化的关键因子，Cbfα1－/－基因敲除小鼠表现为完全的骨组织丧失和牙胚发育阻滞［6］，表明Cbfα1对于骨诱导及牙周组织的发育是必不可少的。人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast cells，HGFs)具有取材方便、容易培养的特点，并且在某些因子的诱导下表现出成骨特性［7－8］，使得 HGFs有望成为牙周组织工程的种子细胞。而Satb2和Cbfα1基因在HGFs中的表达情况目前尚未有报道。本研究通过组织块法培养HGFs，采用 RT－PCR和Western blot方法研究 HGFs中 hSatb2、hCbfα1 的表达，为进一步研究Satb2和Cbfα1基因在牙周组织再生中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

α－MEM、DMEM 培养液(Hyclone，美国);胰蛋白酶(Sigma，美国 );青霉素、链霉素(penicillium，streptomycine);胎牛血清、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(Gibco，美国);TRIZOL(invitrogen公司);PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser(宝生物有限公司);2×Power Taq PCR MasterMix(百泰克生物技术有限公司);BCA蛋白检测试剂盒(凯基生物有限公司);蛋白质相对分子量Marker、6×SDS上样缓冲液(fermentas，美国);PVDF膜 (millipore，美国);HERA cell恒温CO2细胞培养箱(Heraeus公司，德国);Multiskan MK3型酶标仪(Thermo Labsystems公司，芬兰);IXZ－ILL100型倒置相差显微镜(OLMPUS公司，日本);TGL－16G型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);Gene Quant pro紫外/可见光分光光度仪(Biochrom，美国);梯度PCR仪(Biometra，德国);Biofuge Stratos台式冷冻高速离心机(Heraeus公司，德国);蛋白垂直平板型电泳槽、电泳仪、水平电泳槽、PAC－300型电泳仪(BIO－RAD科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 人牙龈成纤维细胞(HGFs)原代培养和传代

收集18～30岁患者因手术而切除的健康牙龈组织，用含50 g/L青链霉素的PBS反复冲洗后，剪除上皮层，将余留的结缔组织剪成1 mm×1 mm×1 mm组织块，铺于培养瓶底，在50 mL/L CO2、37℃ 标准环境下倒置培养2 h后，翻转培养瓶继续培养并观察细胞游出情况。当细胞从组织块边缘爬出并长满瓶底80% ～90%时，胰蛋白酶2.5 g/L+1 g/L EDTA消化传代，取3～6代细胞用于后续试验。

1.2.2 HGFs形态学观察

取生长良好的第4代HGFs胰蛋白酶消化后，以2×105的细胞密度接种于预置有无菌盖玻片的培养皿(36 mm×36 mm)中，标准环境下进行培养。待细胞生长成单层时，取出盖玻片，PBS反复浸洗，950 mL/L乙醇固定，苏木精染色5 min;自来水浸洗，稀盐酸乙醇液分色(数秒即可);自来水再浸洗，用淡氨水使细胞核蓝化3 min;自来水浸洗，伊红染液5 min;自来水浸洗，依次浸入梯度乙醇各1 min;二甲苯透明3次，每次1 min，树胶封片，镜下观察细胞形态。

1.2.3 MTT法检测细胞生长情况

取生长良好的第4代HGFs，以5×103/孔的细胞密度接种于96孔板，同时每孔加入200 μL DMEM培养液标准环境下进行培养。分别于细胞贴壁生长后1、2、3、4、5、6、7 d 各取出一组细胞，每孔加MTT液(5 mg/mL)20 μL，继续4 h后终止培养，吸尽培养液，每孔加 150 μL DMSO，震荡10 min，使结晶物充分溶解后，在酶标仪上测各孔492 nm波长吸光值(OD)，并绘制细胞生长曲线。

1.2.4 RT－PCR 检测 HGFs中 hSatb2 和 hCbfα1 mRNA的表达

采用Trizol法提取细胞总RNA。按照takara公司PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。以GAPDH为内参照，根据Genebank中hCbfα1和hSatb2的基因序列，采用primer premier 5.0计算机软件设计引物，并由上海博尚生物公司合成(表1)。RT－PCR反应条件参照2×EasyTaq PCR SuperMix试剂盒(全式金生物公司)说明书。反应结束后，配制20 g/L琼脂糖凝胶，将PCR产物加入上样孔中(此PCR产物含有染料，不用额外加Loading buffer)，同时在旁边的孔中加入DNA Marker，然后在100 V电压下进行电泳。当指示剂迁移至凝胶的2/3时，终止电泳，凝胶成像系统上观察电泳结果并拍照。

表1 引物序列和长度

1.2.5 Western blot检测 HGFs中 hSatb2 和hCbfα1 蛋白表达

采用Trizol法提取细胞蛋白，按照BCA蛋白测定试剂盒说明检测蛋白浓度后，SDS－PAGE电泳、转膜、封闭、免疫反应，最后进行化学发光反应，分析hSatb2和hCbfα1蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 HGFs的分离、培养及形态学观察

采用组织块法培养HGFs，共培养10瓶，其中有7瓶在一周左右可见少量细胞从组织块边缘爬出，成功率为70%。生长出来的细胞呈贴壁生长，起初形态不规则多呈短梭型，也可见多边形，菱形，细胞核呈圆形、椭圆形，位于胞体中央，核仁清晰，有1～4个。随着传代培养，细胞排列呈束状、平行状或杂乱无章，形态变成细长梭形，并有2～4个胞浆突。传6代后细胞形态保持良好，与原代细胞相比形态更规则。HE染色可见细胞胞浆呈粉红色，胞核呈蓝色(图1～3)。

图1 HGFs原代细胞(×100)

图2 第6代HGFs细胞(×100)

图3 HE染色(×100)

2.2 细胞生长曲线

细胞生长曲线呈不规则的S型，开始前2 d细胞增殖缓慢，从第3天开始细胞增殖加快，到第5天细胞生长速度又变平缓(图4)。

图4 HGFs增殖情况

2.3 细胞hSatb2和hCbfα1 mRNA表达

RT－PCR 检测发现，hSatb2和 hCbfα1 mRNA在HGFs中均呈阳性表达(图5)。

图5 HGFs中 hsatb2、hcbfα1 mRNA 表达

2.4 细胞hSatb2和hCbfα1蛋白的表达

Western blot检测发现，HGFs中有hSatb2蛋白表达，但未发现hCbfα1蛋白的表达(图6)。

图6 HGFs中hSatb2和hCbfα1蛋白表达

3 讨论

HGFs来源于中胚层，是牙龈结缔组织中的主要细胞类型，也是牙周组织中最丰富的细胞，具有活跃的自我更新能力，在牙周组织的形成、再生、保护、修复、维持完整性和功能的实施中起重要的作用［9］，本实验采用原代组织块法体外培养了HGFs，通过MTT法观察细胞的生长曲线，发现细胞在前2 d增殖比较缓慢，从第3天开始增殖加快，一直到第6天才减慢下来，细胞生长曲线近似“S”型。HGFs的体外培养由于来源丰富、取材方便、创伤小且体外培养成活率高，因此HGFs的体外培养将有助于进行牙周组织再生工程的研究。

Satb2和Cbfα1作为成骨细胞分化和骨形成的重要调控因子，对骨的发育起重要作用。目前关于Satb2在牙周组织中表达情况的研究尚少，张瑾等［5］采用原位杂交的方法检测了胚胎14.5 d时野生小鼠头部Satb2的表达情况，发现Satb2在切牙牙胚的间充质中高表达，在上皮成分中不表达，同时在发育的颚骨和下颌骨基质中也有高水平表达，说明Satb2可能在颌骨和牙周组织发育过程中起重要作用。Cbfα1在牙囊和牙乳头中也都有表达而且随着牙齿的进一步发育和牙根、牙周组织的形成，Cbfα1 的表达更为明显［10］，这说明 Cbfα1 可能参与牙周组织的发育。

本实验采用RT－PCR及Western Blot方法分别检测了Satb2和Cbfα1在HGFs中的表达情况，结果显示，Satb2和Cbfα1在mRNA水平上都有表达，只是Cbfα1 mRNA的表达较Satb2弱;而在蛋白水平上，只检测到了Satb2蛋白的表达。提示Satb2和Cbfα1可能在HGFs的骨向分化上作用程度不同，进一步研究Satb2和Cbfα1对HGFs生物学特性的影响，将有利于我们为牙周组织工程寻找更佳的生长因子和种子细胞。

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