中国北方地区汉族人群血小板膜糖蛋白ⅠbαVNTR多态性的分布与脑梗死患者CC基因型与阿司匹林敏感相关性分析

辛晓敏，蒋丽鑫，王 瑶，金英玉，张云平

（1．哈尔滨医科大学附属第一医院 检验科，哈尔滨150001；2．北京朝阳医院京西院区 检验科）

糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰb－Ⅸ－Ⅴ在血小板粘附于损伤的血管内皮细胞中起重要作用并参与剪切力介导的血小板活化。因此，编码GPⅠb基因的多态性可能改变心脑血管疾病风险因素。13个氨基酸序列（丝氨酸399到苏氨酸411）的可变串联重复数目（variable number of tandem repeats，VNTR）导致 GPⅠbα基因呈多态性并表现为A、B、C、D四种等位基因形式。不同民族GPⅠbαVNTR多态基因分布明显不同。

阿司匹林是最常见抗血小板聚集药，被广泛运用于心脑血管疾病的二级预防。然而，数据显示阿司匹林抗血小板作用存在个体差异［1］，可能原因是一些病人存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）。重要血小板膜糖蛋白等位基因的多态性可导致重要黏附受体成分表达量的变化。现已证实，阿司匹林抵抗与血小板P1A1（GPⅢa）［2，3］和 GPⅠbα VNTR多态性BC基因型［4］有关。

本研究探讨中国北方地区汉族人群GPⅠbα VNTR多态性分布情况并分析VNTR多态性的存在是否对低剂量阿司匹林（100mg／d）产生抵抗作用。

1 材料与方法

1．1 对象 选取300例中国北方地区健康的汉族人群；110例脑梗死患者，入院后服用阿司匹林（100 mg／d）至少7d以上，参考 Gum 等［5］的标准排除其它疾病。本项研究经哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会同意，所有受试对象均签署遗传分析知情同意书。阿司匹林抗血小板作用通过光学血小板聚集实验检测。参考Gum等［5］提出的阿司匹林抵抗（AR）定义：以10μmol／L二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）为诱导剂时血小板平均聚集率≥70%，以0．5g／L （arachidonic acid，AA）为诱导剂时血小板平均聚集率≥20%。阿司匹林半抵抗（Aspirin semi－responders，ASR）定 义 为 只 符 合 上 述 条 件 之一［5］。

1．2 VNTR多态基因型 从人类外周血单个核细胞分离出遗传DNA，遗传DNA 0．4ng加入20μl PCR反应体系，该体系包括1．6μl dNTP，0．4μl上游引物（5’－CACTAC TGAACCAACCCCAAG－3’）和0．4μl下游引物（5’－TTGTGGCAGACACCAGGATGG－3’），2．0μl 10×PCR 缓 冲 液，0．1μl（5U）Taq DNA 聚合酶（TaKaRa，大连，日本）。扩增条件：95℃预变性5min；38个循环，循环参数为95℃变性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳（三硼酸盐／EDTA缓冲液），EB染色，确定基因型。100bp DNA作为标准参照物。

2 结果

2．1 健康人群VNTR多态性分布

VNTR基因频率见表1。PCR扩增的DNA片断为195，234，273bp，分别对应 D、C、B等位基因，等位基因A未检测到。等位基因C频率最高，其次是等位基因D。

2．2 患者的流行病学特征

如表2所示，ASR患者中女性、高血压和高血脂者占的比率较AS者高，其他危险因素在ASR和AS患者中无显著差异。本研究没发现阿司匹林完全抵抗的患者，ASR患者为9．1%。ASR患者用AA或ADP作为诱导剂的血小板聚集率明显高于AS患者（P＜0．001）。

2．3 ASR和AS患者VNTR多态性的基因频率

表3可见6种基因型：BB、BC、BD、CC、CD、DD。在AS组中，CC基因型表达最多，其次是CD、DD基因型。与AS组相比，ASR组BC和BD基因型分布增多。

表1 中国东北地区健康人群VNTR基因型与GPⅠbα等位基因

表2 患者的流行病学特征

表3 ASR和AS患者VNTR基因型频率

3 讨论

GPⅠbα是血小板膜表面主要的唾液酸蛋白，在初级止血中起重要作用。VNTR多态性研究始于日本人，他们使用十二基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。Ishida等研究证实了Moroi的发现并报道了亚洲东部地区普遍存在的最多的单体基因型；而Simsek等研究发现在美国白种人中不存在A基因型；Marchese等对意大利白种人研究发现GPⅠbα只存在 、C、D三种基因型，同时对卡斯蒂利亚和吉普赛人的研究中也检测出这三种基因型。1999年，Aramaki等的研究表明，之前报道的仅存在于亚洲东部人群的VNTR A基因型在北美印度安人也存在。这些研究与最初的本土美洲人是从东亚移民到北美的假设相一致。

不同民族GPⅠbαVNTR多态基因型分布明显不同。尽管一些学者报道A基因型存在于中国人群，但本研究仅检测出中国东北地区人群B、C、D三种基因型。我们的研究与中国山东一位学者提出的相一致，可能是东北地区的人群很多是从山东省移民而来所致。

GPⅠbαVNTR多态CC基因型在既往患有脑梗死，同时对阿司匹林敏感的患者中过量表达。本研究不包括使用抗血小板药物治疗有效的心血管疾病患者。尽管VNTR多态CC基因型与阿司匹林敏感显著相关，但由于标本量较少，仍需进一步大规模研究。

GPⅠb－Ⅸ－Ⅴ复合物是血小板表面主要的血管性血友病因子（vWF）受体。vWF与循环血液中血小板相互作用是诱发受损血管形成血栓的始动环节。GPⅠbα呈高度多态，其中一种多态性是编码巨糖肽的VNTR，这种类似粘蛋白的片断分隔配体结合区域从血小板膜表面，此区域包含39个碱基序列串联重复1到4次，对应的基因型为D、C、B、A。随着重复序列的增加，增加了巨糖肽的长度即增加了配体结合区域和血小板膜表面的距离，从而更易接近配体结合区，对剪切力也更为敏感。活性和亲和力的改变决定了整合素的功能。VNTR多态C基因型比A、B基因型短，可以推断长度的不同可以改变对VWF的亲和力 ，从而影响血小板功能，尽管没有足够的证据加以证实［6］。

CC基因型患者对阿司匹林更为敏感，与GPⅠbα和VWF介导的剪切力引起的血小板活化相关。

体外阿司匹林抵抗有重要的临床意义。当前研究表明阿司匹林抵抗的存在使患主要心血管事件的风险增加了3倍以上［7］。检测阿司匹林抵抗有助于患有冠状动脉疾病和脑血管疾病的患者预测和降低主要心血管事件的风险。当患者检测出阿司匹林抵抗时，其他抗血小板治疗尤为重要。阿司匹林抵抗是一直存在抑或随时间发生改变仍不清楚，因此很难决定其他治疗的持续性［3］。

综上所述，通过本研究对脑血管患者提供个体化治疗具有一定的临床意义。更为重要的是抗vWF治疗的疗效受GPⅠbα多态性影响，因此在临床药物研发过程中有必要考虑到这一点。

［1］Patrono C，Coller B，Dalen JE，et al．Platelet－active drugs：the relationships among dose，effective，and side effect［J］．Chest，2001，119，39S．

［2］Macchi L，Christiaens L，Brabant S，et al．Resistance in vitro to low－dose aspirin is associated with platelet P1A1（GPIIIa）polymorphism but not with C807T（GPIa／IIa）and C－5Tkozak（GPI－ba）polymorphisms［J］．Journal of the American College of Cardiology，42（6）：1115．

［3］Pamukcu B，Oflaz H，Nisanci Y．The role of platelet glycoprotein IIIa polymorphism in the high prevalence of in vitro aspirin resistance in patients with intracoronary stent restenosis［J］．American Heart Journal，2005，149（4）：675．

［4］Gervera A，Tassies S，Obach V，et al．The BC genotype of the VNTR polymorphism of platelet glycoprotein Iba is overrepresented in patients with recurrent stroke regardless of aspirin therapy［J］．Cerebrovascular Disease，2007，24（2－3）：242．

［5］Gum PA，Kottke－Marchant K，Poggio ED，et al．Profile and prevalence of aspirin resistance in patients with cardiovascular disease［J］．American Journal of Cardiology，2001，88（3）：230．

［6］Jilma－Stohlawetz P，Homoncik M，Jilma B，et al．Glycoprotein Ib polymorphisms influence platelet plug formation under high shear rates［J］．British Journal Haematology，2003，120（4）：652．

［7］Gum PA，Kottke－Marchant K，Welsh PA，et al．A prospective，blinded determination of the natural history of aspirin resistance among stable patients with cardiovascular disease［J］．Journal of the American College of Cardiology，2003，41（6）：961．