大孔树脂法纯化玉竹总皂苷的工艺研究

王晓林，李 珍，钟方丽*

(吉林化工学院化学与制药工程学院， 吉林 吉林 132022)

大孔树脂法纯化玉竹总皂苷的工艺研究

王晓林，李 珍，钟方丽*

(吉林化工学院化学与制药工程学院， 吉林 吉林 132022)

目的：筛选出分离、纯化玉竹总皂苷的大孔树脂型号及工艺条件。方法：通过静态吸附与解吸实验确定大孔树脂的型号。在静态吸附与解吸单因素试验基础上，利用四因素四水平正交试验对LSA-33型大孔树脂纯化玉竹总皂苷的工艺进行研究，以总皂苷吸附率、解吸率为指标，确定最佳工艺。结果：LSA-33型树脂对玉竹总皂苷具有较好的纯化效果，其最佳工艺为：pH6～7的玉竹提取液，树脂吸附4h，解吸液为体积分数95%的乙醇，解吸液用量与树脂质量比37.5:1(mL/g)，解吸时间为2h时，玉竹浸膏中总皂苷的含量由未纯化前的12.28%提高到41.75%。结论：LSA-33型大孔树脂可较好地纯化玉竹总皂苷，且操作简单、安全、成本低廉，有较高的应用价值。

玉竹；总皂苷；大孔吸附树脂； 纯化

玉竹(Rhizoma Polygonati Odorati)为百合科(Liliaceae)植物玉竹的干燥根茎，性平，味甘，具有养阴润燥、生津止渴的功能，用于热病口燥咽干、干咳少痰、心烦心悸、糖尿病等[1]，广泛分布于东北、华北、华东及湖北、湖南、广东等地，喜阴湿环境，较耐寒，在山区和平坝都可栽培[2]。从玉竹中已经分离鉴定了甾体皂苷、黄酮、生物碱、多糖、甾醇、鞣质、黏液质和强心苷等多类成分[3]，玉竹多糖能够降低糖尿病小鼠的血糖、血脂水平[4]，玉竹总黄酮能清除二苯基苦味肼基(DPPH)自由基，能增强衰老模型小鼠血液中SOD活性，降低肝组织中MDA含量[5]。甾体皂苷是玉竹的活性成分之一，具有降血糖、降血脂、抗菌消炎作用[6]。药理研究表明，玉竹还有强心、扩张血管、降血压、抗肿瘤和增强免疫功能等作用[7]。由于玉竹具有药食两用功能，在市场上已经出现了很多保健食品与保健饮料，如玉竹茶、玉竹面条、玉竹饮料、玉竹果圃等，在我国广东、广西及香港、新加坡、东南亚等国家民间还用于煲汤，保健效果良好。已有研究发现，用大孔吸附树脂富集、纯化黄芪、仙茅、人参等总皂苷，效果较理想[8-10]，而有关玉竹总皂苷纯化工艺的研究尚未见报道。本实验针对6种不同型号的大孔树脂进行了纯化玉竹总皂苷的筛选，并通过静态实验对LSA-33型大孔树脂纯化玉竹总皂苷的工艺条件进行优化，从而为生产中更有效利用玉竹总皂苷、发挥其最大经济效益提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

薯蓣皂苷元对照品 中国药品生物制品检定所；玉竹 安徽省亳州市华申药业有限公司；水为重蒸馏水；大孔树脂(LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33) 西安蓝晓科技有限公司；无水乙醇、甲醇、硫酸、石油醚等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MAS-Ⅱ超声波提取仪 济宁金百特电子有限公司；752N型紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHZD型循环水真空泵 河南省巩义市英峪仪器一厂；CS101-AB型电热鼓风干燥箱 中国重庆实验设备厂；JY2002型电子天平 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总皂苷含量测定

1.3.1.1 标准曲线的制备

精密称取薯蓣皂苷元对照品1.50mg，置于100mL容量瓶中，加入无水甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度0.015mg/mL的薯蓣皂苷元对照品溶液。精密量取薯蓣皂苷元对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL分别置于6个10mL具塞试管中，水浴挥干无水甲醇，加入浓硫酸溶液(1mol/L)10.0mL，置于50℃水浴保温30min，冷却4min，以相应试剂为空白，在410nm波长处测吸光度。以质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，进行直线回归[11]，得回归方程：A＝0.04199C＋0.01078，R＝0.9994，表明薯蓣皂苷元在0.75～12.00μg/mL范围内呈良好线性关系。

1.3.1.2 样品含量测定

取样品液、吸附后液及解吸液各适量，置于10mL具塞试管中，按1.3.1.1节方法，于410nm波长处测定吸光度，以不加供试品的平行样为空白。从标准曲线上计算出供试品溶液中薯蓣皂苷元的质量浓度，供试品中总皂苷的量以薯蓣皂苷元计算。

1.3.2 大孔吸附树脂的预处理

取大孔吸附树脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21各50.0g加入柱内，先以95%乙醇连续洗涤数次约2h，至流出液加水(1:5)不混浊为止，后用蒸馏水洗至无醇味，然后用5% HCl溶液浸泡4h后以4～6BV/h的流速洗涤2h，再用蒸馏水洗至中性，最后用2% NaOH溶液浸泡6h后以4～6BV/h洗涤2h，再用蒸馏水洗至中性，抽滤至干，置于密闭容器中，备用[12]。

1.3.3 玉竹总皂苷样品液的制备

称取干燥玉竹50.0g于250mL圆底烧瓶中，加入50%乙醇溶液150mL超声提取3次，每次30min，过滤，合并以上3次滤液，蒸干，加入100mL的无水甲醇超声溶解，然后加入100mL 15%硫酸溶液回流2h，冷却至室温，转移到分液漏斗中，用石油醚萃取3次，每次100mL，合并石油醚萃取液，将石油醚萃取液旋转蒸发至干，残渣用90%乙醇溶液溶解，过滤，滤液用90%乙醇溶液定容至250mL容量瓶中，待用。

1.3.4 大孔吸附树脂的选择

6种大孔吸附树脂的物理性能见表1。取处理后树脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21各2.0g，加入到100mL具塞三角瓶中，加入30mL质量浓度0.1368mg/mL的玉竹总皂苷溶液[13]，每10min振摇1次，约30s，共2h，静止48h，滤过。分别吸取各树脂吸附后的溶液1.0mL，在410nm波长处测定吸光度(A)，计算各树脂对玉竹总皂苷的吸附率，将静态吸附的树脂抽滤至干，室温条件下，加入100mL95%乙醇溶液解吸，每10min振摇1次，约30s，持续2h，静置48h，过滤。分别取各解吸液1.0mL，于410 nm处测定吸光度(A)，计算各种树脂对玉竹总皂苷的解吸率。各指标的计算公式如下[14]：

表1 6种大孔树脂的物理性能Table 1 Physical properties of 6 types of macroporous adsorption resin

式中：C0为起始样品液中总皂苷质量浓度/(mg/mL)；C1为吸附48h后溶液中总皂苷质量浓度/(mg/mL)；C2为解吸液中总皂苷质量浓度/(mg/mL)；V1为样品液体积/mL；V2为解吸液体积/mL；m1为解吸液干燥后固体的称样量/ mg；m2为解吸液中总皂苷的测定量/mg。

1.3.5 大孔吸附树脂纯化玉竹总皂苷最佳条件的确定

1.3.5.1 静态吸附和解吸单因素试验

(1) 吸附时间的确定

选取LSA-33型大孔树脂进行操作，操作步骤同1.3.4节至解吸前步骤，分别振荡吸附1、2、3、4、5、6、7、8 h，测定溶液中总皂苷质量浓度，计算吸附率。

(2) 解吸液解吸液体积分数的确定

选取LSA-33型大孔树脂进行操作，解吸时乙醇体积为50mL，其余操作步骤同1.3.4节，体积分数分别为10%、30%、50%、70%、90%，计算解吸率。

(3) 解吸液乙醇用量的确定

选取LSA-33型大孔树脂进行操作，玉竹总皂苷溶液质量浓度为0.1365mg/mL，其余操作步骤同1.3.4节，解吸时乙醇体积分别为20、30、40、50、60、70、80mL，过滤后的解吸液分别移取0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2mL于7个具塞试管中，测定溶液中总皂苷的质量浓度，计算解吸率。

(4) 解吸时间的确定

选取LSA-33型大孔树脂进行操作，玉竹总皂苷溶液质量浓度为0.1375mg/mL，其余操作步骤同1.3.4节，解吸时乙醇体积为70mL，解吸时间分别为1、1.5、2、2.5、3 h，计算解吸率。

(5) 吸附液pH值的确定

选取LSA-33型大孔树脂进行操作，玉竹总皂苷溶液质量浓度为0.1358mg/mL，其余操作步骤同1.3.4节至解吸前步骤，分别用5%盐酸溶液和5% NaOH溶液调p H值为4、5、6、7、8、9，计算吸附率。

1.3.5.2 正交试验

通过单因素试验可知，玉竹总皂苷样品液的pH值为6～7时，吸附率较高且比较稳定，在此基础上，固定玉竹总皂苷样品液的pH值为6～7，选择吸附时间、解吸液乙醇体积、解吸液体积分数、解吸时间为考察因素进入正交试验进一步优化工艺。以解吸率为考察指标，确定大孔树脂纯化玉竹总皂苷的最佳条件。正交试验因素水平表如表2所示。所有试验中，每次试验取用的LSA-33型大孔树脂为2.0g。

表2 正交试验设计因素水平表Table 2 Factors and their levels for orthogonal array design

1.3.6 工艺验证实验

选取LSA-33型大孔树脂进行操作，操作步骤同1.3.4节，玉竹总皂苷溶液质量浓度为0.1375mg/mL，调节pH值为6～7，解吸时乙醇溶液的体积分数和体积分别为95%和75mL，计算解吸率。

1.3.7 浸膏中总皂苷含量的测定

称取LSA-33型大孔树脂6.0g，共称取3份，分别置于3个干燥250mL三角瓶中，同时分别取90mL供试品溶液(总皂苷质量浓度为0.1375mg/mL)于250mL三角瓶内，振荡吸附4h，每10min振摇1次，每次振摇30s，分别过滤。然后向过滤后带有树脂的3个三角瓶中各加入225mL 95%乙醇溶液，振荡解吸2h，每10min振摇1次，每次振摇3 0 s，过滤，过滤后的解吸液各取1.0mL于3个具塞试管中，按照1.3.1节的方法测定溶液中总皂苷的含量。再取90mL总皂苷质量浓度为0.1375mg/mL的玉竹总皂苷样品液、上述解吸液220mL倒入称质量后的蒸发皿中水浴蒸干，基本蒸干后放入温度调为60℃的电热鼓风干燥箱中干燥，待其干燥至恒质量后称质量后得差值，得浸膏质量，计算总皂苷的纯度。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂的选择

6种不同型号的树脂在相同条件下，经过48h静态吸附及解吸，分别计算出其对玉竹总皂苷的静态吸附率和解吸率，结果如表3所示。

从表3可以看出，LSA-33型树脂的吸附率最高，D-101型树脂的吸附率最低；从解吸率角度看，D-101型树脂的解吸率最高，达到了95.27%，但吸附率只有36.07%，解吸率仅低于D-101型树脂的是LSA-33型树脂，解吸率达到了83.54%，实验结果表明LSA-33型大孔树脂对玉竹总皂苷的吸附率最高，解吸率也相对较高。故选用LSA-33型大孔树脂作为进一步实验所用的树脂型号。

表3 6种孔树脂对玉竹总皂苷的吸附率与解吸率Table 3 Adsorption and desorption rates of 6 macroporous resins for total saponins in Rhizoma Polygonati Odorati

2.2 单因素试验

2.2.1 吸附时间对吸附率的影响

图1 吸附时间对吸附率的影响Fig.1 Effect of adsorption time on adsorption rate

图1表明，随着吸附时间的增加，吸附率越大，但到达3h后，增长趋势趋于平缓，当吸附时间为4h时吸附率最大，因此，适宜的吸附时间范围应该为3～5h。为了进一步考察吸附时间对纯化效果的影响，选择吸附时间的因素水平为3.0、3.5、4.0、4.5h进入正交试验。

2.2.2 解吸液体积分数对解吸率的影响

图2 解吸液体积分数对解吸率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on desorption rate

随着解吸液体积分数的增加，LSA-33型大孔树脂纯化玉竹总皂苷的解吸率呈现逐渐增加的趋势，当解吸液体积分数为90%时，解吸率最高，结果见图2。为了进一步考察解吸液解吸液体积分数对纯化效果的影响，所以选择乙醇体积分数因素水平为80%、85%、90%、95%进入正交试验。

2.2.3 解吸液乙醇用量对解吸率的影响

图3 解吸液乙醇用量对解吸率的影响Fig.3 Effect of solvent consumption on desorption rate

图3表明，随着解吸液用量的增大，解吸率呈先增大后减小的趋势，当解吸液体积与树脂质量比达到35:1时，解吸率最高，之后略有下降。为了进一步考察解吸液用量对纯化效果的影响，选择解吸液用量/树脂质量(mL/g)因素水平为30、32.5、35、37.5进入正交试验。

2.2.4 解吸时间对解吸率的影响

随着解吸时间的增加，解吸率越高，当到达2h时解吸率最大，之后逐步缓慢下降，结果见图4。为了进一步考察解吸时间对纯化效果的影响，选择解吸时间的因素水平为1.5、2.0、2.5、3.0h进入正交试验。

图4 解吸时间对解吸率的影响Fig.4 Effect of desorption time on desorption rate

2.2.5 样液pH 值对吸附率的影响

实验结果表明，吸附率随pH值的增大呈现逐渐增大的趋势，当吸附液pH6～7时，吸附率最高，之后吸附率随pH值的增大明显下降，所以在实验中将吸附液的pH值固定在6～7范围内即可，结果见图5。

图5 样液pH值对吸附率的影响Fig.5 Effect of initial sample pH on adsorption rate

2.3 正交试验

表4 大孔树脂纯化玉竹总皂苷工艺正交试验设计及结果Table 4 Orthogonal array design protocol and corresponding results

试验结果表明，4个因素对解吸率的影响顺序为：解吸液用量与树脂质量比＞解吸液体积分数＞吸附时间＞解吸时间。大孔树脂静态纯化玉竹总皂苷的最佳条件为样品液pH6～7，吸附时间4h，解吸液体积分数95%，解吸液体积与树脂质量比为37.5:1，解吸时间2h。

2.4 工艺验证实验

经过上述单因素和正交试验的考察，得出采用LSA-33型树脂纯化玉竹总皂苷的较佳工艺：样品液pH值为6～7，吸附时间4h，解吸液体积分数95%，解吸液用量与树脂质量比为37.5，解吸时间2h。为了考察上述优化工艺的稳定性，进行了3次验证实验，结果表明3次实验的吸附率和解吸率分别为50.07%、50.24%、 49.55%和71.38%、71.41%、70.68%，平均吸附率和解吸率分别为49.95%和71.16%，具有较好的重现性。

2.5 浸膏中总皂苷含量的测定

按上述优化的工艺进行3次实验，经LSA-33型大孔吸附树脂处理玉竹总皂苷样品液后，玉竹总皂苷干膏中总皂苷纯度由大约12%提高到42%左右，结果见表5。

表5 工艺验证实验结果Table 5 Results obtained for experimental validation of optimal purification parameters

3 结 论

本实验对6种不同型号的大孔吸附树脂进行了玉竹总皂苷纯化实验，通过对影响大孔吸附树脂吸附及解吸各种因素的系统研究，初步确定了LSA-33型大孔吸附树脂分离纯化玉竹总皂苷的效果比较理想，其最佳工艺为：样品液pH值为6～7、吸附时间为4h、解吸液体积分数95%、解吸液用量与树脂质量比为37.5:1(mL/g)、解吸时间2h。在该条件下，纯化产品中总皂苷的纯度由原来的12.28%提高到42%左右，树脂富集倍数为3倍以上，表明LSA-33型大孔树脂对玉竹总皂苷具有良好的纯化性能，为玉竹总皂苷的工业化生产提供了理论依据。

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Purification of Total Saponins fromRhizoma Polygonati Odoratiby Macroporous Resin Adsorption

WANG Xiao-lin，LI Zhen，ZHONG Fang-li*
(School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China)

Objectives: To find out the best type of macroporous resin and determine the optimal process conditions for separation and purification of total saponins fromRhizoma Polygonati Odorati. Methods: The best type of macroporous adsorption resin for total saponins was determined by static adsorption and desorption experiments. Based on one-factor-at-atime experiments, a four-factor, three-level orthogonal array design was employed for the optimization of four process parameters for improved adsorption and desorption rates. Results: LSA-33 macroporous resin was found to be the best resin among 6 types of macroporous resin tested. The best purification conditions for total saponins were determined as follows: crude extract fromRhizoma Polygonati Odorati(pH 6－7) was adsorbed for 4 h and then desorbed with 95% ethanol at a solvent-tosolid ratio of 37.5:1 (mL/g) for 2 h. As a result, the content of total saponins in the crude extract was increased to 41.75% from 12.28%. Conclusion: LSA-33 macroporous resin is effective in purifying total saponins fromRhizoma Polygonati Odoratiwith the advantages of easy operation, high safety and low cost and thus will have high application value.

Rhizoma Polygonati Odorati；total saponins；macroporous resin；purification

R283.2

A

1002-6630(2012)18-0083-05

2011-08-04

王晓林(1969—)，男，副教授，硕士，主要从事天然产物有效成分的提取及纯化工艺研究。E-mail：wangxiaolin69@eyou.com

*通信作者：钟方丽(1970—)，女，教授，博士，主要从事食品及天然药物研究。E-mail：fanglizhong@sina.com