局部应用A-NK/IL-2治疗的抑瘤作用

高君 王志华 于德水 辛颖 丁颖

我们对A-NK及NA-NK细胞体外扩增情况进行观察，然后用A-NK/IL-2局部或全身应用进行体内的抗肿瘤治疗实验，并与NA-NK进行了比较。结果局部应用A-NK/IL-2治疗比NA-NK/IL-2有更强的抑瘤作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和培养液

1.1.1 完全培养液(CM) 分离制备的A-NK和NA-NK细胞均采用RPMI-1640完全培养液培养。

1.1.2 重组IL-2 南京军事医学研究所研制10万IU/2 ml所用25 cm2和75 cm2培养瓶和培养板均为美国Costar产品。

1.2 肿瘤细胞 恶性纤维肉瘤S180(腹水型)，由本实验室反复传代而建立，皮下接种于昆明纯系小白鼠;

1.3 实验动物 昆明纯系小白鼠，本研究所动物室传代和繁殖，6～8周龄雌性，平均体重16～18 g;严格按照国际标准进行饲养和实验操作。

1.4 小鼠脾细胞分离和制备A-NK和NA-NK细胞 按照Hegenaars 98年的方法，无菌取鼠脾，过200目钢网，研磨成单细胞悬液，将所得单细胞悬液加入尼龙毛柱中，在37℃5%C02培养箱中孵育45 min，以去除B细胞和单核巨噬细胞。用预温37℃的完全培养液轻轻冲洗尼龙毛柱，收集未粘附尼龙毛的细胞，用完全培养液调成2×106/ml，置于塑料培养瓶中水平培养24 h后，移去含未粘附塑料表面的细胞悬液(此即NA-NK细胞)，收集粘附于塑料表面的细胞(即A-NK细胞)，二者分别重悬于含50%自体条件培养基的完全培养液中，继续培养扩增。

1.5 细胞体外扩增情况的观察 将A-NK或NA-NK细胞以1×106/ml的深度加入6孔板，2 ml/孔，设三个复孔，定期换液，每隔三天计数一次，取三孔均值。

以0.4%台盼兰(Trypan Blue)活细胞计数法计数细胞数量，以1:l比例将台盼兰与单个细胞悬液混和，室温中放置2 min，加入到细胞计数板中，镜下观察细胞活力和进行细胞计数，活细胞不着色，死细胞染成兰色。

公式如下:

1.6 肿瘤细胞动物接种 荷瘤小鼠待肿瘤长至1～3 cm(14 d左右)，断颈处死。无菌条件下取出皮下肿瘤，生理盐水冲洗后，将肿瘤组织剪碎研磨，过钢网滤过。离心(1000rpm，5 min)去上清，生理盐水稀释为单细胞悬液，光镜下计数，稀释至1×106个/ml。用l ml注射器吸取肿瘤细胞混悬液0.2 ml(2×105个细胞)，注射至每只小鼠背部皮下，待肿瘤可以触及，进入实验。

1.7 A-NK体内抗肿瘤实验 昆明小白鼠皮下接种Sl80恶性纤维肉瘤细胞1×105/只，荷瘤3 d后分别给每个小鼠局部注射IL-2 1000pIU/只/天，荷瘤5 d后将小白鼠随机分为四组，每组10只，I组为空白对照，Ⅱ组为A-NK/IL-2尾静脉注射(全身治疗)，Ⅲ组为NA-NK/IL-2局部注射，IV组为ANK/IL-2局部注射组。治疗组效应细胞数为5×106/只/次。

1.8 统计学方法 依据数据性质的不同，分别采用方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A-NK与NA-NK体外扩增情况 如表1所示。A-NK在第10天达到增殖高峰，NA-NK于第7天达到增殖高峰。A-NK细胞增加16.08倍，NA-NK细胞增加3.36倍。在整个培养过程中，A-NK扩增指数均高于NA-NK。

表1 A-NK与NA-NK增殖情况的比较

2.2 局部注射效应细胞的抗肿瘤作用和对照组相比，局部注射组(Ⅲ组和IV组)有明显的抑制肿瘤生长的作用(P＜0.05)，尾静脉注射组(Ⅱ组)治疗效果不明显(P＞0.05)，其中A-NK比NA-NK的抑瘤效果更明显。

表2 A-NK与NA-NK局部注射的抗肿瘤作用

3 讨论

本次实验证明A-NK体外扩增指数高于NA-NK。A-NK细胞具有较高的体外增殖能力和细胞毒活性，并且能够浸润到实体瘤内部杀伤肿瘤细胞，是非常有潜力的理想的效应细胞。白细胞介素2(IL-2)是一种由133个氨基酸组成的糖蛋白，通过T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞表面的受体而起作用。IL-2可增加杀伤性淋巴细胞毒性，诱导淋巴因子激活的杀伤细胞的生成，促进B细胞增生和分泌免疫球蛋白，诱导其他细胞因子如白细胞介素1、白细胞介素6等的分泌［1］。本实验说明:局部应用A-NK/IL-2细胞比NA-NK/IL-2细胞有更强的抑瘤作用，A-NK局部注射是行之有效的给药途径，并可减少IL-2全身应用产生的巨大副作用。以LAK/IL-2为基础的生物疗法对实体瘤的治疗效果很大程度上取决于LAK细胞在肿瘤部位的聚集能力。A-NK也不例外。A-NK细胞是外周血NK细胞的一小部分(4% ～30%)，由于具有高水平的增殖能力和细胞毒性以及独特的功能特点，现在已经日益受到研究人员的重视，如何获得足量供常规治疗用的高细胞毒活性的免疫效应细胞是过继免疫疗法需要解决的重要问题之一。

［1］王志华，等.肿瘤细胞因子治疗.中国免疫学杂志，2001，22(3):33-35.