复方鹿仙草片质量控制方法的简化与提高研究

韩桂茹， 张 鹏， 安丽娜， 申玉龙

（1.河北省药品检验所，河北 石家庄 050011；2.承德燕峰药业有限责任公司，河北 承德 067600）

复方鹿仙草片为地标升国标的品种复方鹿仙草颗粒［1］［标准号:WS-10461(ZD-0461)-2002］的改剂型产品，原标准［2］收载了苦参、土茯苓、天花粉的薄层鉴别，氧化苦参碱的定量测定。不论薄层鉴别和定量测定，其样品的前处理都比较麻烦，导致重复性比较差，最为关键的是只对氧化苦参碱进行了测定，从目前的文献［3］得知，苦参碱和氧化苦参碱都是有效成分，并存在互变异构现象，在苦参药材中几乎都是以氧化苦参碱的形式存在，但在制剂中，因含还原性成分或受热时间长，都会使氧化苦参碱减少，苦参碱增多，所以只测定一种成分，无法有效控制产品质量。为此，对复方鹿仙草片质量标准重新进行了简化和提高研究，报道如下。

1 材料、仪器与试药

1.1 材料 复方鹿仙草片(批号:10945001、10945002、10945003)及处方中药材由承德燕峰药业股份有限公司提供；对照药材:苦参(批号:121019-200304)、土茯苓(批号:121439-200401)、天花粉(批号:121361-200401)，对照品:咖啡酸(批号:110885-200102)苦参碱(批号:110736-200934)、氧化苦参碱(批号:110780-200506)购自中国药品生物制品检定所。九香虫和黄药子由河北省医院药剂科陈太平主任药师，分别鉴定为蝽科昆虫九香虫Aspongopus chinensis Dallas的干燥体和薯蓣科植物黄独Dioscorea bulbifera L.的干燥块茎。

1.2 仪器 日本岛津液相色谱仪:配有LC-20AT泵；SPD-M20A二极管阵列检测器；LC-solution色谱工作站；色谱柱:迪马 dimonsil色谱柱(5 μm，4.6 mm ×150 mm)。

1.3 试剂、试药 流动相所用的乙腈、甲醇为色谱纯，其它试剂、试药均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 苦参的薄层鉴别 取本品10片，除去包衣，研细，称取2.0 g，加甲醇5 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取苦参对照药材0.3 g，加甲醇3 mL，超声处理10 min，上清液作为对照药材溶液。再取苦参碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg溶液，作为对照品溶液。吸取对照药材和对照品溶液各5 μL、供试品溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨(10∶2∶2.5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色斑点。经空白验证，空白样品(不含苦参的样品)无干扰(见图1)。

图1 样品中苦参TLC图Fig.1 TLC chromatogram of Sophorae flavescenttis Radix in sample

2.1.2 鹿仙草与土茯苓的薄层鉴别 取土茯苓对照药材0.5 g，加乙醇10 mL，回流提取15 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为土茯苓对照药材溶液。另取鹿仙草对照药材0.5 g，加甲醇3 mL，超声处理10 min，上清液作为鹿仙草对照药材溶液。再取咖啡酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取对照品溶液3 ～5 μL、对照药材溶液 8 ～10 μL、2.1.1 项下供试品溶液5～6μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品和鹿仙草对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色主斑点；再喷以1%磷钼酸无水乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色主斑点。经空白验证，空白样品(不含鹿仙草或土茯苓的样品)无干扰(见图2-A，图2-B)。

2.1.3 为九香虫的薄层鉴别 取九香虫对照药材0.3 g，加甲醇3 mL，超声处理10 min，上清液作为对照药材溶液。吸取对照药材溶液与2.1.1项下的供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨(4∶1∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光主斑点。经空白验证，空白样品(不含九香虫的样品)无干扰(见图3)。

图2-A 样品中咖啡酸和鹿仙草TLC图 图2-B 样品中土茯苓、鹿仙草TLC图Fig.2-A TLC chromatogram of caffeic acid and Balanophorae Herba in sampleFig.2-B TLC chromatogram of Smilacis glabrae Rhizoma and Balanophorae Herba in sample

图3 样品中九香虫TLC图Fig.3 TLC chromatogram of Aspongopus in sample

2.1.4 为黄药子的薄层鉴别 取黄药子对照药材0.5 g，加水 30 mL，煎煮 20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为对照药材溶液。吸取对照药材溶液与2.1.1项下的供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨(10∶2∶2.5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与黄药子对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。经空白验证，空白样品(不含黄药子的样品)无干扰(见图4)。

2.1.5 为天花粉的薄层鉴别 取本品细粉0.3 g，加40%甲醇5 mL，超声处理5 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取天花粉对照药材0.3 g，加40%甲醇5 mL，超声处理10 min，上清液作为对照药材溶液。吸取对照药材溶液和供试品溶液各3～5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-无水乙醇-冰醋酸-水(8∶2∶2∶3)为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以2%磷钼酸无水乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。经空白验证，空白样品(不含天花粉的样品)无干扰(见图5)。

图4 样品中黄药子TLC图Fig.4 TLC chromatogram of Dioscoreae-Bulbifeerae Rhizoma in sample

图5 样品中天花粉TLC图Fig.5 TLC chromatogram of Trichosanthis Radix in sample

2.2 苦参碱和氧化苦参碱测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-甲醇－0.1%磷酸 (1.5∶4∶94.5)；检测波长210 nm；柱温40℃；体积流量1.0 mL/min；理论板数按氧化苦参碱峰计算应不低于2000。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的苦参碱和氧化苦参碱对照品适量，加流动相制成每1 mL含苦参碱和氧化苦参碱各15 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)15 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3 mL，置中性氧化铝柱(φ1 cm，100～120目中性氧化铝2.5 g)上，用70%甲醇洗脱至10 mL量瓶中至约9 mL，加1滴磷酸，用70%的甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。即得。

2.2.4 样品的测定 取供试品，按供试品制备及色谱条件项下，进行提取，制备，进样10 μL，以外标二点法计算含有量，结果见表1。

表1 复方鹿仙草片中苦参碱和氧化苦参碱测定结果(n=3)Tab.1 Contents of matrine and oxymatrine in Compound Luxiancao Tablet(n=3)

2.2.5 测定波长的选择 采用日本岛津液相色谱仪；LC-20AT泵；SPD-M20A二极管阵列检测器；LC-solution色谱工作站，对苦参碱和氧化苦参碱对照品以及复方鹿仙草片中相应色谱峰分别进行光谱扫描，结果表明:苦参碱和氧化苦参碱光谱图相似，其最大吸收都在(205±2)nm附近，且对照品和供试品波峰基本一致，采用210 nm为测定波长。

2.2.6 线性范围 取每1 mL含0.0435 mg和0.2175 mg的苦参碱对照品溶液，分别进样1、2、5、10 μL 和3、5 μL，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果表明:苦参碱进样量在0.0435～1.0875 μg与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为:Y=1652490 X+3517，r=0.99997。再取每1 mL含0.0515 mg和0.3892 mg的氧化苦参碱对照品溶液，分别进样 1、2、5、10、15 μL 和 3 μL，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果表明:氧化苦参碱进样量在0.0515～1.946 μg与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为:Y=1445790X －1324，r=0.999999。

2.2.7 精密度实验 取苦参碱和氧化苦参碱对照品与相应的供试品溶液，各进样5次，每次10 μL，对照品5次测定的峰面积平均值，苦参碱为398810，RSD为 0.56%，氧化苦参碱为 364976，RSD为0.47%；供试品中苦参碱的平均值为317035，RSD为0.13%，氧化苦参碱的为292002，RSD为0.21%。说明精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取精密度试验项下的对照品溶液与供试品溶液，继续每隔一定时间，向高效液相色谱仪注入一针，考察了24 h内的稳定性，其RSD:对照品苦参碱的为0.59%，氧化苦参碱的为0.58%；供试品中苦参碱的为0.36%，氧化苦参碱的为0.32%。说明对照品与供试品在24 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 以高(120%)、中(100%)、低剂量(80%)，取同一批样品(批号:10945001)9份，按供试品制备及色谱条件项下，制备样品溶液，进行测定。同批样品9次测定的结果，苦参碱平均质量分数为1.76 mg/g，RSD为1.40%；氧化苦参碱质量分数1.80 mg/g，RSD为2.06%；二者之和的质量分数含量为3.56 mg/g，RSD为1.58%。说明方法重复性良好。

2.2.10 回收率试验 采用加样回收试验。取已测定的同一批样品9份(批号:10945001)每份0.24 g，精密称定，按高、中、低剂量，加上相应的对照品，按供试品测定项下，制备样品溶液，进行测定，计算回收率。苦参碱的平均回收率为99.09%(n=9)，RSD为1.39%(见表2)；氧化苦参碱的平均回收率为100.18%(n=9)，RSD为2.08%(见表3)。

2.2.11 定量测定专属性试验 取苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液、复方鹿仙草片供试品溶液与空白溶液(处方中不加苦参的样品)，分别采用正文项下的测定条件，进行HPLC色谱测定。样品与苦参碱和氧化苦参碱对照品在同一保留时间有相同的波峰出现，而空白溶液则无相应的峰，证明空白样品不干扰测定，定量测定专属(见图6～8)。

3 讨论

3.1 苦参主含苦参碱和氧化苦参碱，具抗炎、抗肿瘤、镇痛、抗心率失常，镇咳，杀菌等广泛的生物活性。其定量测定，有薄层扫描法，毛细管电泳法，高效液相法等，最常用的是高效液相法。但存在三大弊端:第一，不论药材［4-5］还是制剂［6-7］，前处理方法都比较繁琐、复杂，需用三氯甲烷等毒害溶剂纯化处理，费时长，成本高、效率低、污染环境，危害健康，并直接影响测定结果的准确性。第二，反相色谱的流动相多是缓冲盐中添加十二烷基硫酸钠［8］或三乙胺［9］等，溶质增多，比重增大，压力增高，稍不注意就会损伤仪器和色谱柱，最为关键的是苦参碱或氧化苦参碱多不能用同一流动相同时测定，即便有进行同时测定［10］的二者的保留时间，相差在16 min以上，每测定一针需花费50 min。第三，采用正相色谱［11-12］，必须是特定的氨基柱，其流动相中的有机相要达90%以上，测定成本升高，柱寿命缩短。

表2 样品中苦参碱的回收率试验结果Tab.2 Results of recovery test for matrine in sample

表3 样品中氧化苦参碱的回收率试验结果Tab.3 Results of recovery test for oxymatrine in sample

图6 对照品HPLC色谱图1.苦参碱2.氧化苦参碱Fig.6 HPLC chromatogram of reference substance 1.matrine 2.oxymatrine

图7 复方鹿仙草片HPLC色谱图1.苦参碱2.氧化苦参碱Fig.7 HPLC chromatogram of Compound Luxiancao Tablet 1.matrine 2.oxymatrine

图8 空白样品HPLC色谱图Fig.8 HPLC chromatogram of negative sample

3.2 本研究采用含水甲醇提取样品后，吸取一定量，氧化铝柱除杂，含水甲醇洗脱，滤过，续滤液进样的程序，取代了原方法的氨试液碱化，三氯甲烷提取、中性氧化铝柱除杂，三氯甲烷与三氯甲烷-甲醇(7∶3)洗脱，洗脱液蒸干，定容，滤过，滤液进样的程序。做到了样品处理程序无浓缩、无蒸干、无萃取，简便、快捷、省时、省能源、有效提高了工作效率与方法的重复性和准确性。最为关键的是:采用普通的反相色谱柱，非缓冲盐体系，进行了复方鹿仙草片中苦参碱和氧化苦参碱的同时定量测定，生物碱波峰分离良好，色谱柱耐用性广。

3.3 简化和提高后的质量标准，实现了处方中的味味药材有鉴别，主药中的两种生物碱有定量测定，有效提高了质量检测内容。而且完成六味药材的鉴别，只需样品2.3 g，薄层板5块，提取溶剂35 mL，展开剂50 mL，时间2 h；完成定量测定只需样品0.8 g，前处理时间1.5 h，溶剂35 mL。与原标准相比，在增加3项薄层鉴别和一项定量测定指标的情况下，还比原标准节约有机溶剂420 mL，时间12 h。该研究内容无疑是今后中药质量标准的发展方向。

3.4 本制剂还参照中国药典2010年版一部苦参与文献［12］项下的测定条件，采用waters氨基酸高效液相色谱柱，以乙腈-无水乙醇－3%磷酸(81∶9.5∶9.5)为流动相，进行了测定。结果显示，流动相平衡所需时间长，在平衡过程中正负波动幅度太大。测定时对照品有倒峰出现，苦参碱和氧化苦参碱对照品前端呈现了3个类似于甲醇的溶剂峰，样品溶液中的苦参碱峰与杂质不能分离，且苦参碱的保留时间也与对照品不一致。流动相条件比较苛刻，酸度稍有变化，即由3%变为2.9%，样品溶液就无法分离。不仅如此，流动相中有机相达90%以上，不但测定成本为本方法的16倍以上，而且测定结束后，色谱柱很难用甲醇冲洗干净，降低了色谱柱的使用寿命。

［1］国家药品监督管理局编.Ws-10461(ZD-0461)2002:国家中成药标准汇编，口腔 肿瘤 儿科分册［S］2002:365.

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