前列泰丸的质量分析研究

张晓萍， 丁永辉， 杨 锡， 朱 宇

（1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省食品药品监督管理局，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省食品药品检验所 甘肃 兰州 730000）

前列泰丸是由益母草、萹蓄、红花、油菜蜂花粉、知母 (盐炒)、黄柏(盐炒)六味药材，经水提浓缩等工艺制备的浓缩丸，是由国家药品标准［标准编号:WS3-090(Z-015)-2002(Z)］前列泰片改剂型而来的，具有清热利湿、活血散结的功效［1］，临床上对湿热蕴结、瘀血阻络所致的慢性前列腺炎症有较好的疗效。为完善质量标准，有效控制该制剂的质量，本实验对方中萹蓄、红花、知母、黄柏四味药材采用TLC法定性分析，益母草为方中君药，经查阅文献［2-5］，建立了用HPLC-ELSD法测定其中盐酸水苏碱的方法，方法简便，专属性强，结果准确可靠，重复性好，可为该制剂的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪系列:在线脱气机，四元泵，Lcsolution工作站，柱温箱，ELSD-Ⅱ蒸发光散射器；KH-500DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；德国Sartorius R200D型分析天平(十万分之一)；上海梅特勒AE240型分析天平(万分之一)；CAMAG薄层色谱扫描仪。

1.2 试药 对照品及对照药材均购自中国药品生物制品检定所，盐酸水苏碱对照品(批号110712-200508)；盐酸小檗碱对照品(批号110713-200609)、菝葜皂苷元对照品(批号110744-200509)、山柰素对照品(批号110861-200606)、红花对照药材(批号120907-200609)；前列泰丸(甘肃河西制药有限责任公司提供，批号为090801、090802、090803)；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 薄层鉴别［6］

图1 黄柏药材中盐酸小檗碱的薄层鉴别

2.1.1 黄柏 取本品(3批)1 g，研细，加乙醇30 mL，超声30 min，滤过，滤液水浴蒸干，加甲醇5 mL溶解。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨水(6∶6∶3∶3∶1)为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视［7］。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色荧光斑点。按处方比例及制备工艺，配制缺少黄柏药材的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液，阴性对照无干扰。结果见图1。

2.2.2 萹蓄 取本品(3批)2 g，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水20 mL溶解，水液以三氯甲烷提取两次，每次15 mL，三氯甲烷液弃去，水液加浓盐酸1 mL，三氯甲烷25 mL，水浴回流提取1 h，分取三氯甲烷层，水浴蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取山柰素对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，于紫外灯光下(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色荧光斑点。按处方比例及制备工艺，配制缺少萹蓄药材的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液，阴性对照无干扰。结果见图2。

图2 萹蓄药材中山柰素的薄层鉴别

2.2.3 红花 取本品(3批)3 g，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水15 mL溶解，以乙醚提取2次，每次20 mL，弃去乙醚液，水液加水饱和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取红花对照药材2 g，加水100 mL煎煮1 h，用脱脂棉趁热过滤，滤液浓缩至约15 mL，加乙醇使含醇量达50%，混合均匀，滤过，滤液蒸干，残渣加水15mL使溶解，以水饱和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙醚(3∶2)为展开剂，预饱和15 min，展开，取出，晾干，置饱和氨蒸气中熏15 min，于紫外灯光下(365 nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的蓝色荧光斑点。按处方比例及制备工艺，配制缺少红花药材的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液，阴性对照品无干扰。结果见图3。

图3 红花药材的薄层鉴别

2.2.4 知母 取本品(3批)5 g，研细，加乙醇50 mL，水浴回流40 min，放冷，滤过，滤液浓缩至10 mL，加水25 mL，混匀，用三氯甲烷洗涤两次，每次20 mL，弃去三氯甲烷液，水液加浓盐酸5 mL，水浴回流1 h，放冷，用三氯甲烷振摇提取两次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，加氨试液30 mL洗涤，弃去氨洗液，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取菝契皂苷元对照品［8］，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以含5%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的黄色斑点。按处方比例及制备工艺，配制缺少知母药材的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液，阴性对照无干扰。结果见图4。

2.2 定量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Venusil HILIC柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.2%冰醋酸(79 ∶21)，体积流量1.0 mL/min；柱温30℃；ELSD检测器:空气压缩机350 kPa，雾化室温度47℃，增益值为2，进样量20 μL。

2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取在105℃干燥至恒质量的盐酸水苏碱对照品11.17 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含盐酸水苏碱1.1170 mg的溶液，作为对照品溶液。

图4 知母药材中菝葜皂苷元薄层鉴别

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品，研细，取约5 g，精密称定，精密加入50 mL乙醇［9］，称定质量，超声处理30 min(功率 250 W，频率 100 Hz)［10］，放冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，滤过，精密量取续滤液25 mL，水浴蒸干，残渣加水20 mL使溶解，定量转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次，每次25 mL，弃去乙酸乙酯液，水液水浴蒸干，残渣加乙醇10 mL使溶解，加于中性氧化铝-改性活性炭柱上(内径 1.5 cm，中性氧化铝，色谱纯 100～200目，3 g∶1 g，先乙醇湿法装柱，然后用5%的三乙胺乙醇溶液15 mL预洗)，用乙醇洗脱，收集洗脱液120 mL，水浴蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10 mL量瓶，定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例及制备工艺，配制不含益母草药材的阴性样品，同法制备阴性样品溶液。

2.2.5 方法的专属性考察 在上述色谱条件下，盐酸水苏碱峰与其他成分达到基线分离，且峰形良好；阴性样品试验结果表明提取物中其它成分对水苏碱的测定无干扰，理论塔板数按盐酸水苏碱计不小于6000。结果见图5。

图5 前列泰丸高效液相色谱图

2.2.6 线性关系的考察 取2.2.2项下的对照品溶液5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μL 分别进样，按上述色谱条件记录色谱图，测定峰面积，以峰面积的对数值为纵坐标，盐酸水苏碱对照品进样量的对数值为横坐标，进行线性回归，得回归方程:Y=1.1466X+4.5823，r=0.9999；盐酸水苏碱进样量在5.5850～27.9250 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 取2.2.2项下的对照品溶液，连续进样6次，每次进样20 μL，测定峰面积，结果盐酸水苏碱的RSD为0.22%。

2.2.8 重复性试验 取同一个批号的前列泰丸(批号:090801)，平行取样6份，按2.2.3项法操作并检测。盐酸水苏碱平均质量分数为5.37 mg/g，RSD为0.10%，表明方法重复性较好。

2.2.9 稳定性试验 取同一批号的供试品溶液(批号:090801)，于 0、4、8、12、16 、20、24 h按上述色谱条件分别进样20 μL，按峰面积计算，盐酸水苏碱的RSD值为0.19%，表明供试品溶液中盐酸水苏碱在24 h内稳定。

2.2.10 加样回收率试验 称取已知量的样品(质量分数为5.28 mg/g)9份，分成3组(每组3份)，置50 mL量瓶中，每组分别精密加入2.5204 mg/mL的盐酸水苏碱对照品溶液4、5、6 mL，加乙醇约40 mL，超声处理30 min(功率250 W，频率100 Hz)，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，按2.2.3项下，自精密量取续滤液25 mL起，同法操作，测定，结果见表1。

表1 盐酸水苏碱加样回收率试验结果(n=9)

2.2.11 样品测定 取3批样品，同2.2.3项方法处理样品，作为供试品溶液。用0.45 μm微孔滤膜过滤，各取续滤液20 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，用外标两点法对数方程计算样品中盐酸水苏碱的量，结果见表2。

表2 样品测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 黄柏的TLC鉴别 黄柏中小檗碱的薄层鉴别，据文献报道［11］，曾采用正丁醇-乙酸-水(4∶1∶1∶1)为展开剂展开，发现展开时间太长，且重复性不好，依据小檗碱生物碱的特性及经济的考虑，选用本文所提供的展开剂，结果表明，展开时间适宜，重复性好，斑点清晰。

3.2 萹蓄的TLC鉴别 萹蓄中主要含有山柰素、槲皮素、杨梅树皮素等黄酮类化学成分［12-13］，本实验用双相酸水解的方法提取其中的黄酮类成分作为供试品，用山柰素作对照，点于同一薄层板上，结果显示:供试品中主斑点与山柰素在相同位置显相同颜色，斑点清晰。

3.3 测定供试品纯化方法的考察 研究发现，活性炭对盐酸水苏碱有吸附［14］，用5%三乙胺乙醇溶液使活性炭改性，采用中性氧化铝柱、中性氧化铝-活性炭柱、中性氧化铝-改性活性炭柱分别上样，比较纯化及定量测定结果，实验表明:中性氧化铝-改性活性炭柱能够净化供试品溶液，并使待测成分完全洗脱。

3.4 检测方法和色谱柱的选择 曾采用文献报道的方法［15］，用磺酸基团键合硅胶(SCX)阳离子交换柱，用紫外检器(检测波长192 nm)测定，结果发现杂质干扰很大，分离度差。改用通用型检测器蒸发光检测器(ELSD)进行检测，选择稳定性好的亲水性丙基酰胺键合硅胶柱(HILIC)为色谱柱进行分离，结果表明:样品中盐酸水苏碱与各杂质组分得到基线分离，且色谱峰良好，可用于前列泰丸中盐酸水苏碱的定量测定。

［1］王聪庆，陈 娟，师彦平，等.高效液相色谱法测定前列泰片中山柰素的含量［J］.分析测试与仪器，2008，14(1):50-53.

［2］李 林.水苏碱的研究概况［J］.安徽农业科学，2009，37(3):930-931.

［3］贺东兵.HPLC法测定前列泰胶囊的含量［J］.安徽医药，2005，9(1):46-47.

［4］况 艳，李志浩，郑 芳.HPLC-ELSD法测定产后逐瘀片中盐酸水苏碱的含量［J］.中医药导报，2010，16(12):89-91.

［5］冯 旭，杜成智，梁臣艳，等.HPLC-ELSD测定益母草中盐酸水苏碱的含量［J］.广西中医药，2007，30(6):53-54.

［6］常新全，丁丽霞.中药活性成分分析手册［M］.北京:学苑出版社，2002:699，1619，2042.

［7］李玉琴，陈 磊，逯海龙.伤痛宁膏中冰片、黄柏的薄层鉴别方法的研究［J］.宁夏医学杂志，2010，32(11):1063-1064.

［8］廖洪利，王伟新，赵福胜，等.知母化学成分研究进展［J］.药学实践杂志，2005，23(1):12-14.

［9］王文彤，马雪梅，朱永智.不同溶剂提取对益母草中生物碱含量的影响［J］.天津药学，2003，15(3):5，19.

［10］郭孝武，杨 锐.不同频率超声提取对益母草总碱提出率的影响［J］.中国医院药学杂志，1999，19(8):465-466.

［11］黄有霖，潘 馨.成方中黄连、黄柏的薄层鉴别的研究［J］.海峡药学，2003，15(2):36-37.

［12］赵爱华，赵勤实，林中文，等.萹蓄的化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2002，14(5):29-31.

［13］吴呈祥，陈 君，张 蕾，等.中药萹蓄的质量标准研究［J］.药学与临床研究，2009，17(5):365-369.

［14］王胜伟，朱利敏.HPLC法测定鲜益母草中盐酸水苏碱的含量［J］.西北药学杂志，2006，21(1):15-16.

［15］万 军，周 霞，齐红艺，等.前列泰胶囊中盐酸水苏碱含量的 HPLC 研究［J］.天津中医药，2005，22(5):425-427.