槲皮素对大鼠慢性环孢素肾病的保护作用

谭州科，唐 智，罗 茜，杨亦彬

(遵义医学院附属医院 肾内科，贵州 遵义 563099)

槲皮素对大鼠慢性环孢素肾病的保护作用

谭州科，唐 智，罗 茜，杨亦彬

(遵义医学院附属医院 肾内科，贵州 遵义 563099)

目的建立慢性环孢素A肾病大鼠模型，观察槲皮素对环孢素A导致慢性肾损害的影响。方法在低盐饮食基础上将SD大鼠分为四组：环孢素模型组、槲皮素干预组素、正常对照组、溶剂对照组。慢性环孢素肾病采用橄榄油稀释环孢素A灌药造模，槲皮素灌药干预。4周后处死，分别测定肾功能、尿蛋白和体重变化；HE、Masson染色评判肾脏组织病理学改变及纤维化程度；免疫组化检测肾脏组织TGF-β1的表达情况。结果①环孢素模型和槲皮素干预组大鼠体重明显下降，其血肌酐水平和尿蛋白排泄量均较两对照组明显升高(P<0.01)，但槲皮素干预组上述指标改变明显低于环孢素模型组(P<0.05)。②环孢素模型组肾脏病理组织学改变主要为小管间质损伤，间质纤维化,小管萎缩；槲皮素干预后肾小管损伤以及间质纤维化积分明显低于环孢素模型组(P<0.01)。③环孢素模型和槲皮素干预组肾组织TGF-β1较两对照组明显上调(P<0.01)，但槲皮素干预组肾组织TGF-β1表达明显低于环孢素模型组(P<0.05)。结论槲皮素对慢性环孢素肾病有一定的保护作用，可能与降低尿蛋白排泄、下调肾组织TGF-β1的表达，延缓肾小管间质纤维化进程有关。

槲皮素;环孢素;慢性肾毒性;肾小管间质纤维化

环孢素A(CsA)作为一种有效的免疫抑制剂广泛用于各种实体器官移植(如肾、肝、心等移植)，然而其慢性毒副作用导致的慢性环孢素肾病(CCN)限制了它的长期应用。CCN的主要特征为进行性的肾功能减退、小管间质纤维化和炎细胞浸润【1】。由于目前CsA仍是最重要的一线抗排斥反应药，如何减轻CsA毒副作用倍受关注。槲皮素(QU)是一种从多种植物提取的黄酮类化合物，大量实验证实具有抗肝纤维化、肺纤维化作用【2】，本实验拟通过复制CsA的慢性环孢素肾病大鼠模型，观察槲皮素对CsA致慢性肾损害的影响，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，月龄3～4个月，体重200～220g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，清洁级(合格证号SCXK(渝)20070003)。大鼠颗粒饲料喂养，光照/暗时间为12/12 h循环，室温22～25℃。

1.2 主要药品与试剂 CsA口服溶液由杭州中美华东制药有限公司(50ml:5g)提供，QU购自美国Cayman chemical公司 (含量>95% )，兔抗大鼠TGF-β1多克隆一抗购自美国Santa Cruz公司。羊抗兔IgG 购自北京中杉生物技术公司。

1.3 实验分组及给药 低盐饮食参考照Rosen等【3】介绍的配方，饲料配好后，测定钠含量为0.046%(原子吸收火焰法测定)。低盐饮食饲养7 d后，随机分为4组：环孢素模型组、槲皮素干预组、溶剂对照组、正常对照组，每组6只鼠。将环孢素用橄榄油稀释成8g/L,按剂量为25mg·kg- 1·d- 1；溶剂对照组采用橄榄油2.5 mL·kg- 1·d- 1；槲皮素干预组按以上方法给CsA后，参照文献【4】给予槲皮素15 mg·kg- 1·d- 1,均采用灌胃,每天1次。正常对照组自由饮水。7 d称一次体重，于第4周实验终点前置大鼠于代谢笼，收集24 h尿液，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，下腔静脉采血，分离血清保存于-70 ℃备用；左肾矢状面剖开，置于10%甲醛浸泡，用于组织学和免疫组织化学检查。

1.4 大鼠一般状况观察 体重、饮食、尿量、皮毛、活动度等。

1.5 血、尿生化测定 尿蛋白、血肌酐采用全自动生化分析仪检测。

1.6 肾组织病理学检查 肾脏组织石蜡包埋切片，厚度为3～4 μm。HE染色切片在高倍镜(×400)下,每例随机选择20个不重复视野观察肾小管的变化，参考Shihab【5】报道的方法对标本进行半定量评分，肾小管损伤标准:①肾小管上皮细胞肿胀、小管扩张；②小管萎缩或塌陷；③ 细胞和细胞间空泡形成。评分标准：0分:无小管损伤；0.5 分：5<% 小管损伤；1.0 分:5%～20%小管损伤；1.5分:21%～35%小管损伤；2.0 分:36%～50%小管损伤；2.5分:51%～65%小管损伤；3.0分:>65%。Masson染色观察间质纤维化程度:在100×镜下尽量避开肾小球和血管采集图像，每例采集10个不重复视野，用HP IAS21000病理图文分析系统根据病变的百分数判定积分【6】:0为无病变;0.5为<5% (每视野) ;1为5% ～15%;1.5为16% ～25%;2为26% ～35%;2.5为36%～45%;3为>45%。将呈现为绿色的区域作为阳性目标,以阳性面积与统计总面积的比值作为肾小管间质纤维化的评分标准。

1.7 肾组织TGF-β1免疫组化 肾组织脱蜡、水化，3%H2O2中室温放置，EDTA微波抗原修复，滴加一抗(兔抗大鼠TGF-β1)4℃冰箱过夜，复温、清洗，加入二抗(羊抗兔IgG)37℃孵育，PBS清洗，DAB反应显色，苏木素复染，阳性着染可呈棕黄色。实验均采用PBS代替第一抗体作阴性对照。每张切片随机采肾脏皮质部五个视野，应用计算机图象分析软件IPWin32进行图片采集，以积分光密度(IOD)为指标对各组免疫组化染色进行定量分析。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 实验中各组大鼠共死亡3只，环孢素组2只,槲皮素干预组1只，死亡原因主要是感染、腹腔脓肿等。正常和溶剂对照组大鼠精神状况、饮食、尿量、皮毛、活动度等方面无明显改变，而两模型组(环孢素和槲皮素干预组)大鼠精神萎靡，活动差，饮食饮水量下降和毛发变黄、松乱，皮肤可见感染、破溃、脓肿等，但槲皮素干预组程度较轻。两个模型组大鼠体重明显低于正常或溶剂对照组 (P<0.01)，但槲皮素干预组大鼠体重却高于环孢素组(P<0.05)，(见表1)。

2.2 常规血、尿生化指标 两个模型组大鼠4周时血肌酐、尿蛋白均高于正常和溶剂对照组(P<0.01)，但环孢素模型组较槲皮素干预组升高更明显(P<0.01)，见表1；空白和载体对照组间无明显差异(P>0.05)，(见表1)。

表1 各组大鼠体重、血肌酐、尿蛋白情况

注：与正常或溶剂对照组比较，#P<0.01；与环孢素模型组比较，*P<0.01，★P<0.05。

2.3 肾脏常规病理学检查 正常和溶剂对照组肾小球、肾小管和间质未见明显病理学改变。环孢素模型组、槲皮素干预组肾脏均可见明显的小管和间质改变，主要表现肾小管空泡变性，小管萎缩，肾间质较多的炎症细胞浸润，间质增宽，条带状间质纤维化；槲皮素干预组肾小管损害和间质纤维化评分明显低于环孢素模型组(P<0.05)，(见表2)。

表2 各组大鼠肾小管损害和间质纤维化积分

注：与正常或溶剂对照组比较，#P<0.01；与环孢素模型组比较，★P<0.05。

2.4 大鼠肾脏组织TGF-β1免疫组化检测 正常对照组和溶剂对照组肾组织可见少许TGF-β1表达；两模型组肾组织TGF-β1表达明显增强(P<0.01)，主要见于肾小球、肾小管和肾间质，但槲皮素干预组TGF-β1表达明显低于环孢素模型组(P<0.01)，(见表3、图1)。

表3 各组大鼠肾组织TGF-β1表达水平(IOD值

注：与正常或溶剂对照组比较，#P<0.01；与环孢素模型组比较，*P<0.01。

注：A 正常对照组；B 溶剂对照组；C 环孢素模型组；D 槲皮素干预组。图1 各组TGF-β1免疫组化图

3 讨论

随着CsA在器官移植领域以及各种肾脏病变中的广泛应用，其长期使用可能导致CCN从而影响移植物和患者的生存。由于目前CsA仍是最重要的器官移植一线抗排斥药物并且尚无更好的替代药物，因此，如何预防和减轻CsA的肾毒性、阻止或延缓CCN的进展颇受医学界重视。现阶段对于CCN的防治主要是采取减少或撤除CsA，应用ACEI/ARB、抗氧化剂、他丁类降脂药，但其效果报道不一，移植患者的长期存活率不乐观【7】。

CCN病变以进行性肾功能不全、入球小动脉透明样变性、炎症细胞浸润、肾小管萎缩伴上皮细胞空泡变性，条索状间质纤维化为主要特征。Rosen等【3】给大鼠喂养低钠饲料，造成大鼠钠耗竭(sodium depletion,SoD)，并持续给以CsA 4周后首次成功建立CCN模型。本实验观察到在环孢素模型组大鼠出现体重下降、精神萎靡，饮食饮水量下降和毛发变黄、松乱，皮肤可见感染、破溃等，肾功能进行性下降，组织病理学检查见到肾小管损伤、空泡变性，小管萎缩，肾间质纤维化等，结果与文献报道一致的【8】；此外，由于CsA为脂溶性药物，为便于实验给药本实验采用橄榄油作为溶解介质，实验结果没有发现空白对照组与橄榄油载体对照组间存在着观察指标的差异，说明本实验慢性环孢素肾病模型复制成功。

慢性CsA肾毒性的机制并不十分确切，多认为与肾内RAS系统的激活，NO与NO合酶的失衡，TGF-β1表达上调，细胞调亡增加，炎症介质刺激等有关【1】。新近认为肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾脏病的共同途径【9】，故而，如何有效干预小管间质纤维化进程已成为目前研究热点。

槲皮素是一种黄酮类化合物，可从多种植物及中草药中提取，大量实验表明，槲皮素具有抗肿瘤、抗血小板聚集、抗氧化等作用。国内外有学者观察到槲皮素对于环孢素急性中毒引起的肾损伤有保护作用，其机制可能与其抗氧化作用有关【10】。近年，进一步研究发现槲皮素在肝纤维化、肺纤维化及部分肾纤维化动物模型中有明确的抗纤维化作用【2，11】。本实验发现在给予槲皮素干预性治疗后大鼠体重下降明显减轻、血肌酐和尿蛋白也明显降低，说明槲皮素有减少环孢素肾毒性所致的尿蛋白排泄，延缓肾功能恶化的作用。目前认为TGF-β1是各种肾脏疾病小管间质纤维化进程中的关键因子，可通过多种途径参与肾小管间质纤维化的发生和进展，如诱导其他促纤维化物质的产生，促进细胞外基质的合成，抑制细胞外基质的降解，促进肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞的转分化等【12】，本实验结果显示CsA模型组肾组织TGF-β1表达明显上调，在同时给予槲皮素干预性治疗后TGF-β1表达显著低于CsA模型组(P<0.01)，且病理组织学检查也显示槲皮素干预性治疗后肾小管损伤、肾间质纤维化积分也明显减轻，提示槲皮素可下调肾组织TGF-β1的表达、减轻慢性小管间质纤维化进程从而发挥肾保护作用。在以往的实验中也有学者证实槲皮素抗纤维化作用可能与下调单侧输尿管梗阻大鼠肾脏组织中TGF-β1和CTGF的表达有关【13】。由于慢性环孢素肾病的发生机制较复杂，且致纤维化途径相互影响，故对于槲皮素具体通过何种机制发挥其抗纤维化作用和延缓肾功能恶化有待进一步实验证实。

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Protectiveeffectsofquercetinonchroniccyclosporinenephropathyinrats

Tanzhouke,Tangzhi,Luoqian,Yangyibin

(Department of Nephrology,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo observe the effect of quercetin on cyclosporine A (CsA)-induced chronic renal tubulointerstitial injury through establishing rat chronic cyclosporine nephropathy.MethodsMale SD rats were given low-sodium diet for 1 week and then randomly divided into normal control,CsA model group (intragastric administration with CsA was dissolved in olive oil),quercetin treatment and solvent control groups (intragastric administration with olive oil) .CsA was dissolved in olive oil and intragastrically applied to induce chronic renal injury.Four weeks after quercetin treatment,rats were sacrificed and the body weight,serum creatinine and urinary protein were measured,respectively.Hematoxylin-eosin (HE) and Masson staining were performed to evaluate the morphological changes and renal tissue score.The transforming growth-β1 (TGF-β1) expression in renal tissue was detected by immunochemical assay.ResultsQuercetin treatment alleviated CsA-induced decrease of body weight and increase of serum creatinine and urinary protein.Compared with CsA group,tubulointerstitial injury with interstitial fibrosis and tubular atrophy was attenuated in quercetin treatment guoup.In addition,quercetin reduced CsA-induced TGF-β1 protein expression.ConclusionQuercetin could attenuate CsA-induced chronic renal injury and this effect might be in part related to decreasing urinary protein excretion,downregulating TGF-β1 expression and halting the progression of tubulointerstitial fibrosis.

quercetin;cyclosporine;chronic nephrotoxicity;tubulointerstitial fibrosis

贵州省教育厅自然科学基金项目(NO:黔教科2010044)。

杨亦彬，男，博士，主任医师，研究方向：慢性肾脏病，E-mail:yyb1011@sina.com。

Q946.3;R392-33

A

1000-2715(2012)05-0396-04

【收稿2012-08-26；修回2012-09-15】

(编辑：谭秀荣)