丝胶预处理对糖尿病大鼠胰岛细胞蛋白表达的影响

付秀美，薛景凤，付文亮，陈志宏

（承德医学院基础医学部人体解剖学教研室，河北 承德 0 6 7 0 0 0）

糖尿病是由于体内胰岛素绝对或相对不足引起的以糖、脂肪、蛋白质等代谢紊乱为基础的一种内分泌疾病。糖尿病并发症是患者致残和致死的主要原因，因此，寻找积极有效地预防糖尿病及其并发症的药物已成为研究热点。本研究拟利用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）致糖尿病大鼠模型，探讨彩色蚕茧提取物——丝胶预处理对糖尿病大鼠胰岛细胞Bax、Bcl-2、胰岛素及神经肽 Y（neuropeptide Y，NPY）蛋白表达的影响，为糖尿病的防治提供理论依据及实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组：清洁级雄性SD大鼠36只，体质量200~250 g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：712024。将大鼠随机分为正常组、模型组和丝胶组，每组12只。模型组和丝胶组大鼠均采用 2%STZ（25 mg·kg-1·d-1） 连续腹腔注射 3 d建立动物模型，以血糖（blood glucose，BG）≥16.7 mmol/L为成模标准；丝胶组大鼠于注射STZ前给予丝胶（2.4 g·kg-1·d-1）灌胃 35 d。

1.1.2 试剂：丝胶由彩色蚕茧（承德医学院蚕业研究所提供）经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成；STZ购自美国Sigma公司，临用时用pH4.4的枸橼酸钠—枸橼酸缓冲液配成2%的溶液；血糖检测试剂盒购自保定长城临床试剂有限公司；兔抗胰岛素多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗NPY抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗Bax、Bcl-2单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BG检测：各组大鼠禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血，3 000 r/min离心20 min，收集血清。应用全自动临床生化分析仪酶法检测BG。

1.2.2 胰岛细胞相关蛋白检测：取血后断头处死大鼠，迅速分离胰腺，部分置于液氮中保存，用于免疫印迹检测，其余部分置入Bouins液固定，用于免疫组织化学检测。

免疫印迹法检测胰腺Bax和Bcl-2蛋白的表达：取100 mg胰腺匀浆提取蛋白并定量。取40 μg上样，12%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜。小鼠抗Bax单克隆抗体和小鼠抗Bcl-2单克隆抗体（均为1︰200稀释），4℃过夜，显影。β-actin做内参照。采用Quantity One软件对显影条带进行分析，以Bax/Bcl-2条带与β-actin条带的灰度比值作为蛋白的相对表达水平。

免疫组化法检测胰岛细胞胰岛素和NPY蛋白的表达：常规石蜡包埋固定胰腺组织，连续切片（厚度5 μm）。采用SP免疫组化法观察胰岛细胞胰岛素和NPY蛋白的表达。兔抗胰岛素多克隆抗体（1︰400稀释），兔抗NPY多克隆抗体（1︰50稀释），DAB显色，苏木精复染细胞核。以PBS代替一抗作阴性对照，以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性。每组随机选取5只大鼠，每只大鼠任选5张切片，每张切片选取3个胰岛。采用MiVnt图像分析系统在400倍显微镜下进行定量分析，计算每个观察视野内阳性产物面积占胰岛面积的百分比，取平均值。

1.3 统计学分析

实验数据以x±s表示，应用SPSS 11.5统计学软件处理数据，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BG检测结果

模型组 BG 为（29.45±4.82）mmol/L，明显高于正常组［（10.83±2.03）mmol/L］（P ＜ 0.01）；丝胶组大鼠 BG 为（10.04±2.29）mmol/L，明显低于模型组（P＜0.01）。提示丝胶预处理对糖尿病大鼠BG升高有明显的预防作用。

2.2 胰腺Bax和Bcl-2蛋白的表达

如图1所示：模型组大鼠胰腺Bax蛋白表达明显高于正常组大鼠，Bcl-2蛋白表达明显低于正常组大鼠（P＜0.01）。丝胶组大鼠胰腺Bax蛋白表达明显低于模型组大鼠，Bcl-2蛋白表达明显高于模型组大鼠（P＜0.01）。提示丝胶预处理对糖尿病大鼠Bax蛋白表达升高和Bcl-2蛋白表达降低有明显的预防作用。

2.3 胰岛细胞胰岛素蛋白的表达

胰岛素蛋白免疫组化染色阳性产物为棕黄色颗粒，位于细胞质中，阳性细胞为胰岛β细胞。与正常组大鼠（图2A）相比，模型组大鼠（图2B）胰岛素表达明显降低（P＜0.01）；与模型组大鼠相比，丝胶组大鼠（图2C）胰岛素表达明显升高（P＜0.01），定量分析见图2D。结果提示丝胶预处理能明显抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞胰岛素表达的降低。

2.4 胰岛细胞NPY蛋白的表达

NPY蛋白免疫组化染色阳性产物为棕黄色颗粒，位于细胞质中，阳性细胞为胰岛α细胞。与正常组大鼠（图3A）相比，模型组大鼠（图3B）NPY表达明显升高（P＜0.01）；与模型组大鼠相比，丝胶组大鼠（图3C）NPY表达明显降低（P＜0.01），定量分析见图3D。结果提示丝胶预处理能明显抑制糖尿病大鼠胰岛α细胞NPY表达的升高。

3 讨论

3.1 丝胶预处理对糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡相关蛋白表达的影响

胰岛β细胞增殖和凋亡失衡在糖尿病的发生发展中具有重要作用［1］。研究表明，体内某些抗凋亡基因表达增强，可促进β细胞增殖、抑制其凋亡，进而对抗BG的升高［2］。Bcl-2是公认的抗凋亡基因，可通过多种途径抑制细胞凋亡［3，4］。Bax是促凋亡基因，与Bcl-2有21%的同源性。Bax可互相结合形成同源二聚体，诱导和促进细胞凋亡；Bcl-2可与Bax竞争结合，形成比Bax-Bax同源二聚体更稳定的Bcl-2-Bax异源二聚体，从而使Bax-Bax同源二聚体分开，减弱Bax诱导凋亡的作用［5］。本研究结果表明：丝胶预处理可明显提高糖尿病大鼠Bcl-2表达水平，降低Bax表达水平。增多的Bcl-2可通过阻断凋亡信号传递和凋亡基因产物表达、提高抗氧化能力来抑β细胞凋亡，还可与Bax竞争结合形成Bcl-2-Bax异源二聚体，减弱Bax诱导β细胞凋亡的作用，从而达到预防糖尿病及其并发症的目的。

3.2 丝胶预处理对糖尿病大鼠胰岛细胞胰岛素和NPY蛋白表达的影响

胰岛素是胰岛β细胞分泌的机体内唯一降低BG的激素，在调节机体糖、脂肪和蛋白质代谢方面具有重要作用。葡萄糖是胰岛β细胞分泌胰岛素的生理调节剂，随BG水平升高，β细胞功能逐渐降低，胰岛素分泌逐渐减少，长期高糖可导致β细胞不可逆性损伤和凋亡［6］。NPY由胰岛α细胞合成和分泌，通过自分泌和（或）旁分泌方式调节胰岛素的分泌。NPY可抑制胰岛β细胞分泌胰岛素，β细胞分泌的胰岛素也可通过旁分泌作用抑制NPY的合成和分泌［7，8］。本研究结果表明：丝胶预处理可通过提高胰岛素表达水平、降低NPY表达水平来恢复胰岛β细胞功能并增加β细胞分泌胰岛素，减弱NPY高表达对β细胞分泌胰岛素的抑制作用，有效预防糖尿病的进展。

3.3 丝胶的生物学作用及研究前景

蚕丝是人类最早利用的天然蛋白质之一，主要由外围的丝胶和中心的丝素组成。以往的研究主要集中在丝素方面，约占茧丝成分30%的丝胶作为废料而丢弃，浪费了大量的生物资源。丝胶为高分子水溶性蛋白，由18种氨基酸组成，其中丝氨酸占30%，天冬氨酸和甘氨酸占10%～22%，甲硫氨酸、酪氨酸等含量相对较少［9］。目前对丝胶的研究主要集中在美容、护肤、营养与保健等方面；在治疗糖尿病方面的作用仅有国内学者进行了初步探讨，发现丝胶可有效降低BG［10］。本研究结果表明丝胶可以抵抗STZ对糖尿病大鼠的胰岛损伤。此外，由于丝胶是天然的蛋白质，避免了化学合成药物带给人体的不良反应，因此具有良好的应用推广前景。

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