NADPH氧化酶参与机械牵张大鼠血管平滑肌细胞MCP-1mRNA的生成

孙广萍，于李汀，边晓慧，杨旭，王艳秋，李德天

（中国医科大学附属盛京医院肾内科，沈阳 1 1 0 0 0 4）

以往的研究［1］证实，体内血液流动可对血管壁产生3种主要的力学刺激：（1）由血液流动时对血管壁的摩擦力产生的方向沿血管长轴的切应力；（2）由血压产生的作用于血管壁上的周期性牵张力；（3）由血流静水压力产生的作用于血管壁上的压力。已有研究报道［2］高血压患者其血管壁的周期性牵张力增大，而且实验研究［3］也发现模仿体内高血压状态的周期性机械牵张力会诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs） 产 生 炎 性 因子——单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），从而促进动脉粥样硬化斑块的形成和发展，由此提示高血压时对血管壁产生的机械牵张力对血管壁的炎症以及动脉粥样硬化有着非常重要的作用。但是这种机械力如何引起动脉壁炎症的机制尚不明确。本研究利用Flexcell 3000系统对培养在BioFlex 6孔培养皿中的大鼠主动脉平滑肌细胞给予周期性机械牵张力，观察机械牵张能否引起大鼠VSMCs表达MCP-1mRNA，并进一步探讨NADPH氧化酶在此过程中的作用，明确氧化应激是否参与机械牵张作用下的炎性因子MCP-1 mRNA的表达。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

覆有胶原Ⅰ的硅酮弹力膜的BioFlex 6孔培养盘及Flexercell 3000生物反应系统，购于美国Flexcell公司；亚细胞蛋白质组提纯试剂盒，购于德国Calbiochem公司；RIPA裂解液、HRP偶联的抗山羊抗体、兔抗大鼠Na+/K+ATP酶抗体，均购于美国Cell Signalling Technology公司；Trizol总RNA提取试剂盒、SuperScript First-Strand Synthesis System，购于美国 Invitrogen公司；LC-Fast Start DNA Master SYBR GreenⅠ，购于德国罗氏公司；TaqMan Gene Expression Assay kit，购于美国 Applied Biosystems公司；山羊抗大鼠p47phox抗体，购于美国Santa Cruz公司；DMEM培养液、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶，均购于美国GIBCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：采用酶消化法［4］进行成年SD大鼠主动脉平滑肌细胞原代培养并传代。

1.2.2 细胞牵张：采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养液进行VSMCs培养。5~12代的VSMCs接种于覆有胶原Ⅰ的BioFlex 6孔培养盘，使得细胞密度保持在1×105/孔，当细胞生长接近融合时，换用含0.1%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h使细胞处于静止状态。将6孔培养盘中的细胞随机分为对照组（C组）、机械牵张组（ST组）和机械牵张+二苯基氯化碘盐预处理组（ST+DPI组）。ST组和ST+DPI组在进行机械牵张前1 h分别加入等量的DMEM培养液或DPI（NADPH氧化酶抑制剂，终浓度为10 μmol/L），然后将培养盘固定于Flexercell 3000生物反应系统的底盘上，置于37℃、5%CO2培养箱中，通过连接于培养箱外电脑控制的负压装置对培养盘的硅酮弹力膜进行周期性负压牵张，使附着于硅酮弹力膜上的细胞变形。本实验设置牵张频率60次/min、20%的纵向变形以模拟高血压对血管壁的牵张作用。C组细胞除不接受机械牵张外，余实验条件同ST组和ST+DPI组。

1.2.3 实时PCR法测定MCP-1mRNA：机械牵张停止后采用TRIzol总RNA提取试剂盒抽提细胞内总RNA，采用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检验RNA的纯度。取1 μg总RNA逆转录合成cDNA。按LCFast Start DNA Master SYBR GreenⅠ操作规程进行实时PCR。在PCR总反应体系中同时加入目标基因的引物对与GAPDH引物混合物，在扩增目标基因的同时扩增GAPDH作为内对照。MCP-1的引物序列：上游引物：5′-TGTCCCAAAGAAGCTGT AGTATTTGT-3′，下游引物：5′-TTCTGATCTCACTTG GTTCTGGTC-3′，扩增片段为120 bp。内参GAPDH上游引物：5′-ACTGAGCATCTCCCTCACAATTC′-3′，下 游 引 物 ：5′-TGCAGCGAACTTTATTGATGGTAT-3′，扩增产物长 1 307 bp。

1.2.4 光泽精化学发光法测定超氧阴离子：3组给予不同处理因素的细胞分别经过胰蛋白酶消化后，4℃、1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入冰冷的PBS缓冲液溶解沉淀，使细胞数保持1×105/mL。然后将细胞悬液加入光电读数器中，加入光泽精5 μmol/L（终浓度）启动反应，每15 min测1次，每次测量时间为15 s，化学发光反应以counts/（min·104cells）表示。

1.2.5 Western blot检测细胞膜p47phox：按照亚细胞蛋白组提取试剂盒的方法提取膜蛋白，上清液加入RIPA裂解液，BCA法测定蛋白浓度，加入6×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热变性5 min；每份样本取10 μg膜蛋白，用8%的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；蛋白质用BioRad公司的电转移仪转移到硝酸纤维素膜上；一抗为1∶1 000稀释的山羊抗大鼠p47phox抗体，4℃孵育16 h；二抗为1∶2 000稀释的HRP标记的抗山羊IgG，室温孵育1 h。应用ECL+化学发光试剂在X线胶片上曝光，显影。洗膜后应用兔抗大鼠Na+/K+ATP酶抗体为一抗作为内参检测同等加样量。

1.2.6 统计学分析：实验数据以x±s表示，SPSS13.0软件进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 机械牵张力作用下不同时间点MCP-1mRNA的表达

20%的机械牵张力在1~48 h都明显增加了VSMCs表达MCP-1mRNA，与未进行机械牵张时比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中6~12 h时MCP-1mRNA表达最强，并且至48 h一直持续高水平表达。见图1。

2.2 机械牵张力及DPI对MCP-1mRNA表达、超氧阴离子及膜蛋白p47phox表达的影响

与C组比较，ST组周期性机械牵张力显著增加VSMCs中MCP-1mRNA的表达（约是C组的15倍）、超氧阴离子的产生量和膜蛋白p47phox的表达，差异均有统计学意义（P<0.05）。与ST组比较，ST+DPI组加用NADPH氧化酶抑制剂DPI，明显减少周期性机械牵张力作用下的VSMCs中MCP-1 mRNA的表达、超氧阴离子的产生量和膜蛋白p47phox的表达，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1，图 2。

3 讨论

众所周知，高血压是动脉粥样硬化的易患因素，尤其在血管分叉处，血液流速快，易产生湍流，对血管壁的牵张压力大，病理解剖也往往发现此处动脉粥样斑块的发生概率高且严重。近年来发现炎性反应在动脉粥样硬化的发生发展中起着非常重要的作用［5］，其中MCP-1作为一种炎性因子，能使血液中的单核细胞迁入内膜下活化为巨噬细胞，吞噬脂质形成泡沫细胞，在动脉粥样硬化的早期起着重要作用。同时，在动脉粥样硬化发生后期，MCP-1对于促进斑块的不稳定也发挥着作用。MCP-1不仅来源于炎性细胞，在高血压状态下动脉壁也会产生MCP-1。大量的研究［6］表明，患有高血压的人或实验动物其动脉壁的MCP-1的表达均增高，尤其在粥样斑块的部位MCP-1表达量增高明显；体外应用Flexcell力学加载系统对培养的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞进行机械牵张以模拟高血压状态对血管壁的力学牵张作用的实验研究也表明，周期性机械牵张能诱使血管内皮细胞和血管平滑肌细胞产生MCP-1。同样，本实验也证明20%的周期性机械牵张力的加载使大鼠VSMCs表达MCP-1mRNA增加，且在6~12 h时表达量最多，说明高血压能通过诱导血管壁的VSMCs产生MCP-1进而产生炎性反应。

表1 3组细胞超氧阴离子含量、MC P-1mR N A及膜蛋白p 4 7 p h o x表达T a b.1 P r o d u c t i o n o f s u p e r o x i d e i o n a n d e x p r e s s i o n o fMC P-1mR N Aa n d me mb r a n o u s p 4 7 p h o x i n d i f f e r e n t g r o u p s

越来越多的资料表明，活性氧自由基（reactive oxysen series，ROS）在高血压诱导的动脉粥样硬化中起到重要作用［7］。无论在高血压人群还是高血压动物模型中ROS的产生均增加。增高的ROS一方面直接使内皮细胞损伤、内膜屏障作用减弱、血脂浸润，同时激活内皮细胞，释放内皮素，表达黏附分子；另外单核细胞被ROS激活后，可通过核因子κB的激活诱导诸如肿瘤坏死因子、白介素等多种细胞因子的表达。细胞因子诱导巨噬细胞和内皮细胞进入内皮层，氧化低密度脂蛋白，后者被巨噬细胞膜上的清道夫受体识别，进行不受负反馈调节的摄取，脂质过度积聚，平滑肌细胞在ROS的间接作用下迁移、增生，形成泡沫细胞，最终导致动脉粥样硬化形成。

ROS除来源于炎性细胞外，近年来发现血管内皮细胞及平滑肌细胞也能在高血压等多种致病因素的作用下产生ROS，而且血管壁的NADPH氧化酶产生的ROS在动脉粥样硬化的发病机制中起到关键作用［8，9］。已知血管平滑肌细胞NADPH氧化酶是由质膜结合亚基Nox-2或Nox-4、p22phox以及胞质调节亚单位p47 phox、小GTP酶结合蛋白Rac组装成的一种高度调节的多亚基氧化酶复合体［9］。失活状态的NADPH氧化酶，其胞质存在的调节亚基与胞膜结合亚基是分离的，当在刺激因子作用下，NADPH氧化酶的活化依赖于胞质调节亚基p47 phox转位至胞膜与结合亚基相结合。活化的NADPH氧化酶以NADPH为底物产生超氧阴离子，后者再进一步间接促进H2O2产生。那么在高血压状态下，增高的机械牵张力能否通过诱导VSMCs的NADPH氧化酶活化产生超氧阴离子并进一步上调MCP-1mRNA？既往的研究表明，周期性机械牵张力的加载能通过上调Nox-2及p22phox蛋白及mRNA的表达，也能通过增加p47 phox膜转位活化NADPH氧化酶，从而增加超氧阴离子的产生［10］。本实验表明，20%的机械牵张力的加载使VSMCs的胞膜p47 phox表达增加，超氧阴离子产生增加，12 h后MCP-1mRNA表达明显增加，而在加载机械牵张力前1 h加入NADPH氧化酶抑制剂DPI与VSMCs共孵育明显减少胞膜p47 phox表达，抑制了超氧阴离子产生，12 h后MCP-1mRNA表达明显下调，由此说明高血压所带来的对血管壁增高的机械牵张作用能通过增加VSMCs胞质调节亚基p47 phox的膜转位来活化NADPH氧化酶，使得原位超氧阴离子产生增多，进一步增加MCP-1mRNA表达，由此进一步证明氧化反应介导了高血压对血管壁造成的炎性反应，也提示我们在降压治疗的基础上，抗氧化治疗也为防治高血压引起的血管壁的炎性反应提供了可能的治疗靶点和途径。

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