应用16S rDNA短序列片段鉴定常见嗜尸性丽蝇

石 坚，郭亚东，匡栩源，兰玲梅，蔡继峰，2，王红杰

（1.中南大学基础医学院法医学系，湖南 长沙 410013；2.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室，上海 200063；3.中山市公安局小榄分局，广东 中山 528415）

应用16S rDNA短序列片段鉴定常见嗜尸性丽蝇

石 坚1，郭亚东1，匡栩源1，兰玲梅1，蔡继峰1，2，王红杰3

（1.中南大学基础医学院法医学系，湖南 长沙 410013；2.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室，上海 200063；3.中山市公安局小榄分局，广东 中山 528415）

目的 利用16S rDNA中289bp序列对常见嗜尸性丽蝇进行种类鉴定。 方法 从14个省市户外采集丽蝇科3属6种共计26个蝇类样本。利用CTAB法提取蝇类胸肌DNA，对16S rDNA的289bp基因片段进行PCR扩增，检测扩增产物，测序并上传至GenBank，按邻接法构建系统发育树，通过序列分析建立种内及种间进化分歧表。 结果 上述蝇类按照不同属、种分别聚类，其种内进化分歧均数均为0，种间进化分歧均数在0.3%～6.5%。 结论 16S rDNA上289bp基因序列能有效地对国内常见丽蝇进行种类鉴定，应用该片段具有快速、低耗等优点，为应用嗜尸性丽蝇推断死亡时间提供可能。

法医遗传学；昆虫学；DNA，核糖体；嗜尸性昆虫；丽蝇科

法医昆虫学的主要任务是对各类嗜尸性昆虫进行迅速、准确的种类鉴定，进而对死亡时间（postmortem interval，PMI）和死亡地点进行推断[1-2]。尸体上最早发现的往往是双翅目（Diptera）丽蝇科的蝇类，因而其在死亡时间推断中的作用极其重要[3]。但是，通过形态学来鉴定丽蝇种类的难度较大，尤其是丽蝇幼虫形态学上的差距较小，不易鉴别[4]。分子鉴定方法作为形态学鉴定方法的补充手段，被越来越多的法医昆虫学研究者所接受，近年来国内外出现了大量嗜尸性蝇类分子鉴定的研究报道[4-7]。上述研究多采用COⅠ和COⅡ全序列进行种类鉴定，该序列全长约2.3 kb，具有较高的鉴别效力。然而全序列不利于嗜尸性昆虫分子标记的推广和应用，尤其不适合基层法医工作者[8-9]。线粒体DNA（mtDNA）的16S rDNA已被证实可以用来进行麻蝇科[9]、家蝇科[10]及部分丽蝇科[11]的种类鉴定。本研究对嗜尸性丽蝇mtDNA 16S rDNA中289bp序列片段进行分析，对我国14个省市常见的6种嗜尸性丽蝇进行种类鉴定。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）（美国Amresco公司），2×GoTaq®Green Master Mix PCR试剂盒（美国Promega公司），蛋白核酸测定仪（美国Eppendorf公司），9600型PCR扩增仪（美国PE公司），Tanon EPS-300电泳仪（上海天能科技有限公司）。

1.2 样本

随机采集兰州、银川、天津、临沂、北京、新乡、芜湖、长沙、湘阴、大同、石家庄、南宁、福州、包头、海口14个省市15个地区放置于室外草地家兔尸体上的6只丝光绿蝇Lucilia sericata（Meigen）、6只叉叶绿蝇Lucilia caesar（Greenbottle）、1只反吐丽蝇Calliphora vomitoria（Linnaeus）、2只巨尾阿丽蝇Aldrichina grahami（Aldrich）、9只大头金蝇Chrysomya megacephala（Fabricius）、2只绯颜裸金蝇Achoetandrus rufifacies（Macquart），共26只。此外，采用麻蝇科（Sarcophagidae）的2只棕尾别麻蝇Sarcophaga peregrina（Robineau-Desvoidy）作为外群。上述样本用75%的乙醇杀死，室温风干保存。

1.3 mtDNA的提取

取样本胸肌，清洗、捣碎，用CTAB法[12]提取胸肌mtDNA，并溶解于TE缓冲液中，于-20℃保存备用。

1.4 PCR扩增

引物采用Primer 5.0软件设计，引物序列为：正向引物5′-CGCTGTTATCCCTAAGGTAA-3′，反向引物5′-CTGGTATGAAAGGTTTGACG-3′。采用Green Master Mix PCR试剂盒对16S rDNA中289 bp的目标片段进行扩增，扩增体系总体积为25 μL，其中含有40 ng DNA模板，6 μL dNTP（1 mmol/mL），1.0 U Taq聚合酶，2.5μL缓冲液（其中Mg2+1.5mmol/L），双向引物各2.5 μL（10 μmol/L），加去离子水至25 μL。PCR扩增条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50.8℃ 30 s，72℃ 30s，38个循环；72℃ 5min。

1.5 测序与进化分析

PCR产物由华大基因武汉分公司测序，测序结果上传至GenBank，然后用MEGA 4.0软件包进行结果分析，对上述所得不同地区各种蝇类的数据按邻接法（neighbor-joining）[13]构建不同地区蝇类种内和种间的系统发育树，探讨地区差异性及种内和种间的遗传关系。

2 结 果

2.1 形态学分类鉴定结果

上述26只蝇类经形态学分类鉴定，均属丽蝇科，分为3属6种。绿蝇属：丝光绿蝇、叉叶绿蝇；金蝇属：大头金蝇、绯颜裸金蝇；丽蝇属：反吐丽蝇、巨尾阿丽蝇。

2.2 基因序列比对分析

将所测得的上述26只蝇类样本mtDNA上16S rDNA中的289 bp基因序列在GenBank中作BLAST搜索，利用核酸序列分析软件MEGA 4.0对序列进行比对，并将完整的序列提交GenBank注册（表1）。结果表明不同属、种之间存在着比较明显的序列差异。

表1 样本种类、采集信息和16S rDNA部分基因序列GenBank登录号

2.3 邻接法建立系统发育树

运用MEGA 4.0软件包对上述各种蝇类mtDNA上16S rDNA的289 bp基因序列进行分析，用邻接法（neighbor-joining）建立系统发育树，结果按照不同属、种分别聚类，能够达到鉴别蝇类种类的目的（图1）。

图1 基于样本蝇类mtDNA 16S rDNA中289bp基因序列构建的系统发育树

2.4 种内及种间进化分歧

运用MEGA 4.0软件包对各蝇类mtDNA上16S rDNA的289bp基因序列进行分析后，建立种内及种间进化分歧表。

种内分歧：上述6只丝光绿蝇、6只叉叶绿蝇、2只巨尾阿丽蝇、9只大头金蝇、2只绯颜裸金蝇和1只反吐丽蝇mtDNA上16S rDNA的289bp基因序列的种内进化分歧均数均为0（表2）。种间分歧：上述6种蝇类的种间进化分歧均数在0.3%～6.5%（表3）。

一般认为，种内进化歧数应小于3%，种间进化歧数应大于3%，最好大于5%，但要结合片段的长度和位置进行分析。

26 ~，1 8歧分化进间种及内种列序因基289bp中A NrD16S上A N tD m蝇丽性尸嗜只262表25242322212019181716151413121110987654321号序0.000 12 0.0000.0003 0.0000.0000.0004 0.0000.0000.0000.0005 0.0000.0000.0000.0000.0006 0.0210.0210.0210.0210.0210.0217 0.0000.0210.0210.0210.0210.0210.0218 0.0000.0000.0210.0210.0210.0210.0210.0219 0.0000.0000.0000.0210.0210.0210.0210.0210.02110 0.0000.0000.0000.0000.0210.0210.0210.0210.0210.02111 0.0000.0000.0000.0000.0000.0210.0210.0210.0210.0210.02112 0.0390.0390.0390.0390.0390.0390.0430.0430.0430.0430.0430.04313 0.0030.0390.0390.0390.0390.0390.0390.0430.0430.0430.0430.0430.04314 0.0000.0030.0390.0390.0390.0390.0390.0390.0430.0430.0430.0430.0430.04315 0.0500.0500.0500.0580.0580.0580.0580.0580.0580.0650.0650.0650.0650.0650.06516 0.0000.0500.0500.0500.0580.0580.0580.0580.0580.0580.0650.0650.0650.0650.0650.06517 0.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03918 0.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03919 0.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03920 0.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03921 0.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03922 0.0000.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03923 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03924 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03925 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0390.0390.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0320.0390.0390.0390.0390.0390.03926蝇金裸颜绯为17，16~蝇丽阿尾巨为5，14~1蝇丽吐反为 ，13蝇绿叶叉为 ，7~12蝇绿光丝为 ；1~6类种分区够能，大较数均歧分化进间种，小较数均歧分化进内种的类蝇性蝇尸金嗜头述大上：为注26

表3 6种嗜尸性丽蝇mtDNA 16S rDNA中289bp基因序列种间进化分歧

3 讨 论

近年来，利用嗜尸性麻蝇进行死亡时间推断的报道较多[14-15]，而利用嗜尸性丽蝇进行死亡时间推断的报道较少，主要原因在于繁多的嗜尸性丽蝇种类使得形态学鉴别要点极为复杂，不易被广大法医工作者所掌握，此外为了得到相对容易鉴别的成虫，往往需要把收集的幼虫或蛹带回实验室，培养至成虫阶段再进行种类鉴定，这一步骤会消耗大量时间，给案件的迅速侦破带来不利影响，同时还有孵化失败的风险。

1994年Sperling等[5]首次将基于DNA的方法用于嗜尸性昆虫种类鉴定，在此后的十多年中，DNA分子鉴定方法作为形态学鉴定方法的补充手段，被越来越多的法医昆虫学研究者所接受。虽然COⅠ+COⅡ全序列分析是获取信息量最全的方法，也是较精确的分析方法，但全序列无疑会耗费较多的经费和时间，因此有必要对短片段鉴定进行研究。目前文献报道的最短片段约为200bp[8]，这类短序列扩增比较容易，对样本保存条件要求也比较宽松，不足之处是这类片段所包含的信息量过少。

本研究通过MEGA 4.0软件包运用统计学上的距离法构建系统发育树，推断其亲缘关系及遗传距离，进而达到对嗜尸性丽蝇进行种类鉴定的目的。实验结果表明，在属的水平，丽蝇科的绿蝇属和金蝇属、丽蝇属区分较好。不同蝇类的种间差异明显（表3），说明运用该方法可有效地对嗜尸性蝇类鉴定到种的水平。应用16S rRNA中289bp基因序列的分子鉴定结果与形态学分类鉴定结果一致，说明通过检测嗜尸性蝇类mtDNA上16S rDNA中289bp基因序列来进行种属鉴别的方法是可行的。本实验中所运用的方法，可以直接获得严格准确的序列信息，对检测人员专业水平及实验设备的要求不高，一般的分子生物学实验室均能做到，理论依据以及研究思路也相对简洁清晰，容易在实际工作中推广应用。实验中观察到虽然种间差异明显，可以达到种类鉴定的目的，但巨尾阿丽蝇和大头金蝇的种间差异较小（表2），两种并非近缘种，形态学差异也十分明显，这可能是因为实验所选取的289 bp基因序列片段小，所含的信息量相对较少所造成的，也可能是样本量过小，需要补充数据后进一步研究。

分子鉴定作为形态学鉴定的辅助手段具有较高的实践应用价值，小片段分子标记具有高效、快速、经济、简单等优点，利于在我国基层进行推广应用，但小片段分子标记存在着一定的缺陷和不足，仍需要更为深入的研究和探索。

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2011-04-01）

（本文编辑：李成涛）

Identification of Sarcosaphagous Calliphorid Flies by Analyzing the Sequence of 16S rDNA

SHI Jian1,GUO Ya-dong1,KUANG Xu-yuan1,LAN Ling-mei1,CAI Ji-feng1,2,WANG Hong-jie3
（1.Department of Forensic Medicine,School of Basic Medical Science,Central South University,Changsha 410013,China;2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R.China,Shanghai 200063,China;3.Xiaolan Branch of Zhongshan Public Security Bureau,Zhongshan 528415,China）

Objective To explore the application of a 289 bp fragment of the 16S rDNA gene to identify various species of sarcosaphagous Calliphorid flies.Methods Twenty-six Calliphorid flies were collected from 14 Chinese provinces.All specimens were properly assigned into three genera and six species.The DNA of the pectoralis was extracted using CTAB method.Then PCR amplification was done for the 289bp fragment of the 16S rDNA gene.The PCR products were then purified and sequenced,and the obtained sequences were uploaded to GenBank.The phylogenetic tree was built by the neighbor-joining method and intraspecific and interspecific divergences were calculated by sequence analysis.Results The above 26 sarcosaphagous flies could be well clustered according to different genera and species.The evolutional intraspecific values were all zero,the evolutional interspecific variations varied from 0.3%to 6.5%.Conclusion The 289 bp fragment of the 16S rDNA of sarcosaphagous flies can be effectively used to identify most of the flies at species level.This method appears to be fast and low dissipative,which might be used to estimate postmortem interval by sarcosaphagous flies.

forensic genetics;entomology;DNA,ribosomal;sarcosaphagous insects;Calliphoridae

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.04.010

1004-5619（2012）04-0281-06

湖南省自然科学基金资助项目（11JJ5075）；上海市法医学重点实验室资助项目（KF1203）

石坚（1988—），男，陕西西安人，2008级临床医学学生；E-mail：shijian88116@163.com

蔡继峰，男，教授，主要从事法医昆虫学研究；E-mail：cjf_jifeng@163.com