鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备

刘希良，王开卓，成 嘉，蒙 涛，陈敦学，李玉珑，张红芳，张建社，褚武英

(1.长沙大学生物工程与环境科学系，中国 长沙 410003；2. 广西师范大学生命科学学院，中国 桂林 541004；3.九江学院 生命科学系，中国 九江 332005)

肌球蛋白是肌肉主要构成蛋白质之一．它由Kuhne于1859年首先报道，之后于1864年在研究骨骼肌收缩时发现并命名[1]．肌球蛋白不仅是基础蛋白收缩系统主要成分，也是一种复杂多聚体蛋白，在真核生物肌肉收缩过程中起到很关键作用[2-3]．在不同的动物种类之间，乃至鱼类不同品种间，肌球蛋白结构和表达存在着种属间差异性．大部分研究工作主要针对脊椎动物骨骼肌肉(主要是兔和鸡)、心脏肌肉、数种平滑肌而进行，同时也包括部分非肌肉系统肌球蛋白的研究．在鱼类中研究较多的是平滑肌组成的心肌肌球蛋白和横纹肌组成的肌肉肌球蛋白[4]．肌球蛋白不同类型的重链基因全序列克隆测序在多种脊椎动物中已经完成，其中包括大鼠(Rattasnorvergicus)[5]、鸡[6]、人[7]以及鱼类中的斑马鱼[8]、大头鱼、虹鳟[9]、鲤鱼[10]，大黄鱼[11]和鳜鱼[12]等．因此，对鱼类肌球蛋白分子研究已扩展到不同鱼类品种肌球蛋白重链、轻链的基因克隆分析及其表达．Lied和Decken采用生物化学方法分离提取出虹鳟肌球蛋白重链，并采用此蛋白作为抗原制备出多克隆抗体，鉴定出其结合蛋白[11]．Crockford等[13]和Goldspink等[14]采用哺乳动物cDNA序列为引物从鲤鱼基因文库中克隆出其肌球蛋白重链基因，且证实此类基因表达受环境因子所控制；Kato和Konno测定出鲤鱼重链氨基末端和羟基末端分子结构和调节区域[15]．有关鱼类肌肉特异性基因肌球蛋白轻链(myosin light chains，MLC)、肌球蛋白重链(myosin heavy chains，MyHC)的cDNA序列分析所获取的数据，为蛋白质和基因结构进化分析提供基础．这些克隆和分离的基因已经用于研制核酸杂交探针，来研究肌球蛋白基因家族转录产物特异性组织表达、进化，以及染色体定位或突变等．

本研究旨在通过将鳜鱼肌球蛋白重链基因片段亚克隆到pET-32a质粒，构建出重组表达载体，大量诱导表达此蛋白，制备鳜鱼肌球蛋白重链多克隆抗体，为日后分析鳜鱼肌球蛋白重链基因表达对其肉质性状的影响，进而提高鱼类肉质品质提供理论基础和技术支持．

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂

体重1 kg 左右的鲜活鳜鱼购买于长沙水产市场，剪腮放血后取背部白色肌肉，-80 ℃冰箱保存备用．大肠杆菌菌种BL21(DE3)和DH5α均购于北京天根公司．原核表达载体pET-32a为本实验室保存．限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ购于TAKARA公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司；100 bp Marker、MarkerⅢ、PCR扩增所需的试剂以及一抗Anti-His Antiboby 和二抗羊抗鼠购于北京天根公司；T4DNA连接酶、低相对分子质量标准预染及非预染蛋白质Marker购于Fermentas公司；DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于Promega公司；His融合蛋白纯化预装柱购于上海悦克生物科技有限公司．羊抗兔辣根过氧化物酶标二抗、DBA显色试剂盒购于武汉博士德生物公司．其余化学试剂均为国产分析纯．

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 根据作者已克隆得到的鳜鱼MyHC全长序列(GenBank：HQ829291)及原核表达载体pET-32a的载体图谱，利用Primer Premer5.0软件设计一对引物，其序列分别为：

上游引物P+ 5′CAGAATTCATGGAAGAGTCCATTGAGGCTG3′(双下划线部分为引入的EcoRⅠ 酶切位点，粗体字为引入的起始密码子)；

下游引物P-5′GCGAAGCTTCTAGTTCCTCTTGATTTGCTCC3′(双下划线部分为引入的HindⅢ 酶切位点，粗体字为引入的终止密码子)．

1.2.2 目的基因PCR扩增 采用Trizol一步抽提法提取鳜鱼肌肉组织的总RNA后根据反转录试剂盒(Fermentas)合成第一链cDNA，并以其为模板进行PCR扩增．PCR扩增条件为：94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃反应10 min．PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后用DNA胶回收试剂盒进行纯化．

1.2.3 原核表达载体构建 pET-32a质粒经EcoRⅠ和HindⅢ 双酶切处理回收后与同种酶双酶切后的PCR纯化产物在T4DNA连接酶的作用下16 ℃过夜，将目的基因定向连接到pET-32a载体上，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种于含50 mg/L氨苄青霉素LB固体培养基平板上37 ℃过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，提取质粒进行双酶切鉴定，挑选阳性克隆送上海生工生物有限公司测序．

1.2.4 重组质粒的原核表达及重组蛋白的纯化 把构建好的表达载体pET-32a-MyHC转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，取单个菌落接种到LB液体培养基中，37 ℃振荡过夜，取上述培养物以体积比1∶100比例接种于200 mL LB液体培养基，37 ℃振荡培养3 h左右，至OD600值达0.5时，取1 mL菌液作为诱导前对照，分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mmol/L的IPTG，37 ℃分别诱导1、2、3、4、5 h，收集菌液进行150 g/L SDS-PAGE电泳，观察不同IPTG浓度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响．

1.2.5 抗血清的制备 用 Ni-NTA 纯化表达的鳜鱼MyHC融合蛋白，然后将纯化的MyHC融合蛋白皮下多点注射新西兰兔，共免疫3次．注射的抗原均为MyHC蛋白与弗氏完全佐剂按体积比1∶1混合液．首次免疫后，每隔两周加强免疫一次．末次加强免疫后两周采集少量血液，ELISA检测血清抗体效价．之后，颈动脉放血，离心分离血清，即得到鳜鱼MyHC蛋白的多克隆抗体，分装后-80 ℃保存．

1.2.6 Western blot分析抗体特异性 使用哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒提取鳜鱼肌肉组织总蛋白，-20 ℃保存备用．分别取空白质粒pET-32a细菌裂解液、鳜鱼肌肉总蛋白、纯化的MyHC蛋白，经100 g/L SDS-PAGE电泳后湿法转到NC膜上，使用50 g/L脱脂奶粉/TBST 4 ℃封闭过夜．加入一抗(兔抗MyHC血清，浓度比1∶1 000稀释)4 ℃过夜孵育，TBST清洗3次后加入二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，浓度比1∶2 000稀释)，TBST清洗，HRP-DAB显色，至出现明显条带后终止反应．

1.2.7 免疫组化分析抗体的特异性 石蜡切片脱蜡、水化；3%(体积分数)H2O2室温孵育15 min；蒸馏水冲洗，微波炉内抗原修复15 min；自然冷却后，蒸馏水冲洗；PBS冲洗3次，每次5 min；50 g/L BSA室温封闭30 min；倾去封闭液，滴加浓度比1∶2 000稀释的兔抗MyHC多克隆抗体(一抗)，室温孵育1 h；PBS冲洗3次，每次5 min；滴加二抗生物素标记兔IgG(浓度比1∶1 000)，室温孵育20 min；PBS冲洗3次，每次5 min；BCIP/NBT显色；自来水冲洗，核固红轻度复染，水洗，干燥后水溶性封片剂封片，镜检．用PBS代替一抗作为阴性对照．

2 实验结果

2.1 重组表达载体pET-32a-MyHC的构建

将重组表达质粒pET-32a-MyHC经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定结果如图1．其中，大于4 500 bp条带为酶切载体大小，500 bp左右的条带为目的基因片段大小．同时以单菌落为模板，经菌落PCR鉴定，结果如图2，可见在500～600 bp间有一条明显的特异条带．

M：Marker Ⅲ；1：重组质粒双酶切 M：100 bp Marker；1：菌落PCR图1 pET-32a-MyHC酶切鉴定琼脂糖电泳结果 图2 目的基因片段菌落PCR鉴定结果

挑选阳性重组克隆菌送至上海英竣生物技术有限公司测序，获得了一条1 078 bp的基因序列，通过DNAstar软件分析，该序列37-621位核苷酸序列(包括酶切位点)与预期插入pET-32a载体的肌球蛋白重链基因片段一致，该目的基因片段长567 bp．重组表达菌体测序结果与原序列完全一致，且有很好的完整性，说明MyHC目的片段按正确方向插入了pET-32a表达载体中，成功构建了表达载体pET-32a-MyHC．

2.2 鳜鱼MyHC原核表达及条件优化

将重组表达载体pET-32a-MyHC(实验组)和空载体pET-32a(对照组)转化到宿主菌BL21中，分别利用IPTG诱导，经SDS-PAGE检测结果如图3和图4．其中，对照组显示一条相对分子质量约为17 000的特异性条带，即为pET载体的His标签蛋白；而实验组在相对分子质量约40 000处出现一条较明亮的条带，即为His-MyHC融合蛋白．His标签蛋白的相对分子质量约为17 000，而插入的小清蛋白目的片段预测其蛋白相对分子质量大约为25 000，因此，MyHC融合蛋白的相对分子质量理论上接近40 000，这与SDS-PAGE电泳结果一致，表明重组表达质粒pET-32a-MyHC经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21中成功表达出His-MyHC融合蛋白．

M：蛋白Marker ； 1～5：不同IPTG浓度诱导的含pET-32a-MyHC的BL21菌体，其IPTG浓度依次为0，0.2，0.6，0.8，1.2 mmol/L；6：0.8 mmol/L IPTG诱导的含pET-32a的BL21菌体图3 鳜鱼MyHC基因不同IPTG浓度诱导表达结果

M：蛋白Marker ；1，2：0.8 mmol/L IPTG下诱导的含pET-32a的BL21菌体；3-8：诱导0，1，2，3，4，5 h诱导的含pET-32a-MyHC的BL21菌体图4 鳜鱼MyHC基因不同时间诱导表达结果

2.3 MyHC重组融合蛋白表达形式

0.8 mmol/L IPTG，37 ℃诱导培养4 h后，菌体进行超声波破碎后，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果显示上清液中有目的条带，如图5，证明MyHC重组蛋白主要以可溶的形式存在．

2.4 Western-blot鉴定重组融合蛋白

重组蛋白pET-32a-MyHC在SDS-PAGE电泳后，通过电转移将表达产物转移到硝酸纤维素膜上，利用抗His为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP为二抗，在HRP-DAB底色显色反应下，对pET-32a-MyHC转化到BL21菌中并表达的重组融合蛋白进行Western检测分析(图6右)，结果表明，经IPTG诱导后的目的蛋白pET-32a-MHC可以和抗体发生强烈的免疫反应．因此可以确定重组载体成功表达了重组融合蛋白(相对分子质量约40 000的蛋白为目的蛋白)．

M：蛋白Marker;1：未诱导的重组质粒；2：含重组质粒菌体诱导后破碎沉淀；3：含重组质粒菌体诱导后破碎上清液图5 MyHC融合蛋白表达的SDS-PAGE分析

2.5 间接ELISA对抗体效价的测定

以纯化后的表达产物融合蛋白MyHC作为抗原，100 μg /孔包被，以HRP标记的羊抗兔IgG抗体作为二抗，用免疫后的兔血清抗体做梯度稀释，以免疫前兔血清为阴性对照，ELISA间接法测抗体，结果显示阴性对照一直无明显的变化，而当多克隆抗体稀释倍数为4.0×106时，纯化好的融合蛋白与阴性对照OD值比仍大于2倍．因此，融合蛋白MyHC对兔抗多克隆抗体具有良好的免疫原性，抗体滴度为1∶(4×106)(图7)．

2.6 鳜鱼MyHC蛋白免疫印迹

分别取空白质粒pET-32a细菌裂解液，抽提鳜鱼肌肉总蛋白(蛋白提取液：1%的NP-40(体积分数，下同)；1 g/L SDS；9.1 mmol/L Na2HPO4；2.94 mmol/L NaH2PO4；0.15 mol/L NaCl；10% PMSF；5 g/L Leupeptin；5 g/L NaDeoxgcholate)，经SDS-PAGE电泳后转印至NC膜上，50 g/L脱脂牛奶4 ℃封闭过夜．加入一抗(兔抗MYH血清，1∶5 000稀释)，TBST(20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，体积分数为0.05% Tween 20)清洗3次，每次5 min；然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，1∶10 000稀释，室温孵育1 h，TBST清洗3次，每次5 min；最后加入DAB显色，待出现明显条带后用水冲洗终止反应．

预测鳜鱼肌球蛋白重链蛋白相对分子质量约为 240 000[16]．用自制的MYH抗兔血清对鳜鱼总蛋白的western blotting 结果(图8)显示，在相对分子质量为240 000左右出现清晰的条带，见图中第3泳道；而阴性对照空白pET-32a见图中第4泳道，在相应位置未识别出该蛋白条带．Western免疫印迹实验表明，MyHC抗血清可以与肌细胞中相对分子质量为240 000左右的蛋白质发生特异性交叉反应，与文献报道的MyHC的相对分子质量一致，显示MyHC多克隆抗体具有高的特异性．

图7 间接ELISA测抗血清效价

M1：非预染蛋白Marker；1：阴性对照(pET-32a质粒细菌裂解液)；2：鳜鱼肌肉总蛋白.M2：预染蛋白Marker ；3：鳜鱼肌肉总蛋白；4：阴性对照(pET-32a质粒细菌裂解液)图8 (A)鳜鱼肌肉总蛋白SDS-PAGE检测结果 (B)鳜鱼MyHC蛋白免疫印迹结果

2.7 免疫组化结果

由图9(放大倍数200×)可以看出，兔抗MyHC多克隆抗体免疫鳜鱼肌肉，在背部的肌肉细胞产生阳性细胞(图9B)，呈黄棕色(灰度处理后为深灰色)，而在阴性对照组中未出现该阳性信号(图9A)，与预想结果一致，说明该抗体是特异性的．

A 阴性对照 B 阳性图9 鳜肌肉MyHC免疫组化结果

3 讨论

为了获得稳定的目的基因片段和可溶状态的重组蛋白，克隆片段起始位置应位于保守性较高且亲水性高的区域．作者在设计引物前利用DNAstar软件对鳜鱼肌球蛋白重链基因进行亲/疏水性预测[16]，结果显示鳜鱼肌球蛋白重链基因亲水性氨基酸多集中于850～1 983位．分析鳜鱼MyHC的保守结构[17]，作者选择在Myosin_tail_1亲水性氨基酸集中的区域(1 404～1 592位氨基酸)对应的核苷酸序列进行克隆和表达．基因的高效表达是在载体、基因和受体细胞的协同作用下完成的，主要受启动子、SD序列、转录终止序列、载体系统等因素的影响[18-21]．宿主的选择及培养条件的控制等因素对外源基因在原核细胞中的表达效率也有很大影响．本实验所选用的表达载体大肠杆菌BL21具有T7启动子，可通过化学诱导高效地表达外源蛋白，目的蛋白前端的促溶蛋白(相对分子质量约为17 000)可以增加蛋白的表达及可溶性．同时，BL21含有6个组氨酸标签，可以提高外源表达蛋白的表达效率而不影响目的蛋白的高级结构，从免疫组化和免疫印迹结果来看, 作者表达出的带有His标签的蛋白也没有影响到抗原抗体特异结合的性质[22]．同时多聚组氨酸标签对外源重组蛋白的纯化也具有一定的作用．

进行融合蛋白诱导时， 蛋白极易以包涵体的形式表达， 而包涵体形成后的缺点是需变性、 复性等复杂处理过程后才能得到可溶性融合蛋白质．为了避免变性复性等复杂过程，通过改变诱导的时间和 IPTG的浓度，摸索到最适宜的条件为0.8 mmol/L IPTG诱导3 h．

肌球蛋白重链( MyHC)具有ATPase活性、肌动蛋白结合位点以及a螺旋卷曲螺旋尾部等重要特性，是决定肌纤维收缩性质的主要分子之一．本研究以前期研究中已经克隆的鳜鱼MyHC序列[23-24]为目的基因，利用大肠杆菌BL21作为表达载体，对目的基因进行原核表达载体的构建和多克隆抗体的制备．研究成果为进一步研究肌球蛋白重链对肉质的影响，提高优良肉质性状提供理论支持．

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