非典型新城疫的综合诊断试验



非典型新城疫的综合诊断试验

陶新萍 （山东省昌乐县红河镇畜牧兽医站 262411） 刘恩昌 （山东省昌乐县畜牧兽医局）

本试验对某蛋鸡场疑似患非典型新城疫的鸡进行了病理学、血清学及病原学综合诊断。诊断结果表明：鸡群表现有呼吸道症状、消化道症状及产蛋性能下降的非典型新城疫的基本症状；剖检病变胃肠道及呼吸道出血性卡他性炎症，卵泡充血、出血，输卵管萎缩等均符合新城疫的病变特征；病毒性脑炎、淋巴组织坏死是具有证病意义的新城疫组织病变；结合发病前后HI抗体检测结果及新城疫的病毒分离鉴定，综合判定该鸡群所患疾病为非典型新城疫。

非典型新城疫；蛋鸡；诊断；病毒分离

新城疫(Newcastle disease，ND)也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒(NDV)引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病[1]。非典型性新城疫一般发生于用过新城疫疫苗免疫过不久的鸡群，一般不呈爆发性流行，多散发，发病率在5%~10%左右。发病后临床症状不明显，有轻微的呼吸道症状，大群精神正常，采食量变化不大，粪便变化不明显，死亡率不高，产蛋鸡出现产蛋量下降，产软壳蛋等。剖检病变不典型，只见病鸡上呼吸道有卡他性炎症，消化道淋巴滤泡聚集处黏膜充血、肿胀。产蛋鸡除上述病变外，卵泡萎缩、变形、液化，严重者卵泡破裂，卵黄散落腹腔，引起卵黄性腹膜炎[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 发病鸡群 鸡群为21周龄开产不久的蛋鸡。病初鸡群采食量下降，有轻度呼吸道症状，咳嗽，个别甩头，有些鸡拉绿色稀粪。产蛋下降，每天下降2%~5%，蛋的形状和质量稍有变化，颜色略淡，软壳蛋、薄壳蛋增多。持续10几天后开始恢复，但恢复不到原来的水平。后期死亡率开始上升，死鸡多因继发大肠杆菌或支原体感染。

1.1.2 试验动物 该鸡群病死鸡及症状明显的鸡；9日龄SPF鸡胚购自购自山东省家禽研究所。

1.1.3 主要仪器 LDZ4-0.8自动平衡微量离心机，冰箱，净化工作台，96孔“V”型血凝板，PW-30精密培养箱，8道可调移液器，冰冻切片机。

1.2 方法

1.2.1 病理剖检 取病死鸡和症状明显的鸡按常规方法进行剖检。尤其观察脑、气管、肺、胰腺、心脏、腺胃、肌胃病变，以及肠道变化。然后无菌取病料。

1.2.2 组织病理学检查 在剖检观察后取病鸡脑、气管、肺、脾、肠道等组织器官，10%福尔马林固定，常规石蜡切片、HE染色，光镜下观察。

1.2.3 血凝(HA)和血凝抑制试验(HI) 从发病鸡场随机抽取16只鸡，采血，静置。然后4000r/min，离心5min，提取血清。然后做血凝和血凝抑制实验[3]。

1.2.4 病毒分离与鉴定 无菌采集10只疑似ND病死鸡的脑、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等组织，剪碎、置于消毒的匀浆器内，加入灭菌的PBS缓冲液研磨成1:5的悬液，每毫升悬液加入双抗(青霉素和链霉素)各2000IU，冻融3次，5000r/min离心10min，取上清液经细菌滤器过滤，置4℃冰箱作用8h后，-20℃保存备用。取9日龄的SPF鸡胚，通过照蛋标出鸡胚和气室部位，然后分别用5%碘酊和75%酒精消毒气室，干燥后用无菌的打孔器打孔。然后将处理好的样品的上清液，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔中，每个样品做两个平行试验，共接种20枚鸡胚，0.1ml/胚，置37℃温箱中孵育。弃去24h内死亡胚，每6h照蛋一次，及时取出死亡鸡胚，置4℃保存。有明显病变者无菌收集鸡胚尿囊液，作细菌检样后放-20℃保存备用。观察鸡胚的病理变化。检测尿囊液HA滴度，若能凝集鸡红细胞，则进行HI试验。经72h不死亡者，取尿囊液继续盲传三代不能致死鸡胚方可判为阴性[3]。

2 结果

2.1 病理变化

2.1.1 剖检病变 喉头、气管明显充血出血，气管黏膜有多量浆液性渗出液。腺胃变软、变薄，腺胃乳头间有出血。小肠肠壁变薄，肠壁毛细血管充血或出血，与周围界限明显。小肠上有数个大小不等的黄色泡状肠段。剪开该肠断，可见肠壁呈橘黄色，缺乏弹性，肠黏膜脱落。肠管淋巴滤泡肿胀，盲肠扁桃体出血肿大，泄殖腔黏膜有出血点。卵泡充血、出血、或液化破裂，输卵管萎缩。后期死亡的病鸡常表现卵黄性腹膜炎、输卵管炎、心包炎等继发病变。

2.1.2 组织病理学变化 病鸡脑膜充血、淋巴细胞浸润，脑血管充血，血管周围淋巴细胞袖套样浸润。脾脏淋巴细胞广泛性坏死、崩解。肺淤血，二级支气管内有大量红细胞。

2.2 血清学检查

鸡群发病后进行的HI试验结果见表1。由于该鸡场发病前在实验室做过定期抗体检测，检测结果见表2。比较鸡群发病前后HI抗体效价的变化发现，发病后2周左右鸡群HI抗体效价均显著升高，且离散度变大。

表1 鸡群发病后新城疫抗体水平检测结果 (log2)

表2 鸡群发病前新城疫抗体水平检测结果 (log2)

2.3 病毒分离鉴定

鸡胚接种样品上清液后，10份样品中有6份样品接种的鸡胚在48h内死亡，死亡胚体全身弥漫性出血，尤其是胚的头部、颈部和脚爪出血严重，形成紫红色出血斑，肝脏点状出血斑和坏死灶。收取尿囊液，细菌检验为无菌。对采集的尿囊液进行的血凝试验(HA)和血凝抑制实验(HI)。HA试验有凝集红细胞特性，血凝价达8个滴度，并且均被ND阳性血清所抑制，而不能被禽流感H9、H5阳性血清所抑制。有2份样品接种的鸡胚在60h内死亡，胚体出血不明显，收取尿囊液做HA实验，有凝集红细胞特性，凝集效价为7，且该尿囊液的血凝特性可被抗ND阳性血清所抑制，而不能被禽流感H9、H5阳性血清所抑制。有2份样品，经72h不能致死鸡胚，收取尿囊液做HA实验，无凝集红细胞特性，取该尿囊液盲传3代均不能致死鸡胚。

3 讨论

鸡群的ND抗体水平已显著升高，抗体水平高，平均抗体水平为10.56，1/3的鸡只超过11以上且高低不均、离散度大。可怀疑曾被ND野毒感染。8份病料经接种鸡胚分离到新城疫强毒，可直接判定新城疫野毒感染；2份病料盲传3代均不能致死鸡胚，有可能未感染新城疫野毒，也有可能该鸡群感染病毒时间较长，鸡群抗体水平高，带毒量少。结合传统临床诊断看到的非典型新城疫的典型病变与两种实验室诊断得到的结果可以很有把握地判定该鸡群患非典型新城疫。

一般新城疫的诊断只是经过临床诊断和病理剖检就判断鸡群是否患新城疫。但这只能初步诊断，即使有经验的兽医也可能会误判。这样会给养殖场带来很大的损失。何况非典型新城疫症状不典型，更增加了诊断出错的风险。而本试验结合实验室诊断，检测出病鸡体内含有新城疫病毒，就可下定论。另外，HA和HI特异性好，经济适用，是实验室最常用的抗原抗体检测方法，而且操作步骤简单，操作人员只要经过一段时间训练后方能进行操作。因此，大型的养殖场可以利用血凝和血凝抑制试验检测免疫效果，指导生产实践，增强鸡群免疫力；也可用于禽病诊断。这样可以给养殖场带来更大的收益。但HI抗体测定会受许多因素的影响，同一份血清在不同实验室的测定结果往往不同，为获得准确结果，一方面操作人员严格按要求规范操作，每次均进行重复试验，另一方面设立标准阴、阳性血清作对照，从而减少测定误差。

在本病例中鸡群临床表现有呼吸道症状、消化道症状及产蛋性能下降的非典型新城疫的基本症状。剖检病变小肠肠壁变薄，肠壁毛细血管充血或出血，与周围界限明显。肠壁黏膜层呈橘黄色，缺乏弹性，肠黏膜脱落，肠淋巴滤泡处肿胀，卵泡充血、出血，输卵管萎缩等剖检病变均符合新城疫的特征性病变。初步判断该鸡群患非典型新城疫。做了组织病理切片后观察到的病毒性脑炎、淋巴组织坏死具有证病意义的新城疫组织病变；发病前后HI抗体检测结果对比对新城疫亦具有证病意义；结合新城疫的病毒分离鉴定的阳性结果，综合判定该鸡群所患疾病为非典型新城疫。

[1] 陈溥言主编. 兽医传染病学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2008.

[2] 刁有祥主编. 禽病学[M]. 北京: 中国农业科学技术出版社, 2008.

[3] 姚火春主编.兽医微生物学实验指导[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002.

（2012–07–12）

S858.31

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1007-1733(2012)11-0013-02