大鼠坐骨神经切断后丙戊酸钠对相应脊髓运动神经元p－ERK1／2表达的影响

刘浩宇，吴广智，崔树森

（吉林大学中日联谊医院 手外科，吉林 长春130033）

胞外信号调节激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）是信号网络中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的一员，ERK1／2的活化具有抑制细胞凋亡、促进创伤愈合及神经再生的作用［1］。丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）是目前临床上应用较广的抗癫痫药物，近年来研究［2，3］发现大鼠脑组织损伤后VPA对其具有保护神经元、降低炎性反应、促进神经再生等作用。但是，关于VPA的作用机制却不清楚。因此，作者通过建立大鼠坐骨神经损伤模型，应用VPA进行干预，检测损伤相关的脊髓运动神经元胞体中p－ERK1／2的表达情况，继而探讨VPA对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 健康雄性Wister大鼠64只，体重250－300g（吉林大学动物实验室），随机分为：对照组：即单纯坐骨神经切断组，实验组：即：丙戊酸钠组，每组32只。各组按手术后1、3、7、14d分为4个时间点，每个时间点8只。主要试剂：一抗：p－ERK1／2－1（Promega公司），β－actin（Sigma公司），VPA片（江苏省恒瑞制药有限公司）。使用浓度及方法严格按照说明书配制。

1.2 给药方法 术后当天给药。丙戊酸钠组给VPA片，将药片取出研成粉末后用生理盐水稀释成50ml／L混悬液灌胃，每1ml悬液含生药0.05g，按大鼠每250g体重1.5ml给药，每日给药1次，相当于生药300mg／（kg.d），作为实验组；单纯坐骨神经切断组坐骨神经原位缝合后给予生理盐水，按每100g体重1ml灌胃，每日1次，作为对照组。

1.3 模型制备与取材 3%戊巴比妥钠40mg／kg腹腔麻醉大鼠，术区常规消毒，做右侧臀部斜行切口，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，将坐骨神经完全切断，在12倍手术显微镜下将其神经两端正确对位后，用9－0无损伤线吻合断端4针，逐层闭合创口。

1.4 免疫组化法 石蜡切片脱蜡后室温孵育，5%－10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育、去血清，滴加适当比例稀释的一抗p－Erk1／2兔抗鼠单克隆抗体（1：100），4℃孵育过夜。DAB显色、冲洗、复染、封片。结果判定：阳性为细胞内出现棕黄色颗粒。①不着色为阴性（细胞着色比例＜10%），②染色呈淡黄色为弱阳性（＋）（10%＜细胞着色比例＜25%），③黄色为阳性（＋＋）（25%＜细胞着色比例＜50%），④棕黄色为强阳性（＋＋＋）（50%＜细胞着色比例）。

1.5 Western blot 快速将液氮中的组织取出，研碎、裂解细胞，分离提取蛋白，测定浓度，每个泳道15ug，进行8%SDS－PAGE电泳。转至PDVF膜，一抗p－ERK1／2抗体（1：2500），4℃摇床轻摇孵育过夜，二抗Goat Anti Rabbit IgG，FITC偶联抗体（1：5000）室温摇床轻摇2小时。按ECL显色试剂盒说明书操作显色，X光胶片曝光，然后进行条带扫描和分析P－ERK1／2表达。

1.6 统计学方法 将Western blot条带扫描和分析，各组计量数据以±s表示，采用SPSS 10.0版软件进行统计分析，组间比较采用t检验分析，P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠坐骨神经切断后，VPA对脊髓运动神经元p－ERK1／2表达的定位分析 400倍镜下观察：对照组：1d时，运动神经元胞质中p－Erk1／2表达呈强阳性（＋＋＋），胞核中未见表达（图1－1）。3d时，胞质仍呈强阳性表达（＋＋＋），胞核中未见表达（图1－3）。7d时，胞质内呈黄色为阳性表达（＋＋）（图1－5）。14d时，逐渐衰减呈淡染，为弱阳性表达（图1－7）。实验组：1d时，运动神经元胞质中p－Erk1／2表达呈强阳性（＋＋＋），胞核中未见表达（图1－2）；3d时，胞质仍呈强阳性表达（＋＋＋），胞核中未见表达（图1－4）；7d时，胞质内呈黄色为阳性表达（＋＋），可见少量细胞核内有表达（图1－6）；14d时，逐渐衰减呈淡染，为弱阳性表达（图1－8）。

2.2 大鼠坐骨神经切断后，VPA对脊髓运动神经元p－ERK1／2表达的定量分析 Western blot结果显示（图2）：对照组：术后3d时，p－ERK1／2的表达达到高峰；术后7－14d，p－ERK1／2的表达逐渐下调。实验组：术后3d时，p－ERK1／2的表达达到高峰；术后7－14d，p－ERK1／2的表达逐渐下调。组间数据分析显示：术后1－7d，实验组相关p－ERK1／2表达明显高于对照组（P＜0.05）具有统计学意义。

3 讨论

ERK是信号网络中丝裂原活化蛋白激酶家族的一员，坐骨神经切断后各种刺激的传导可能引起相应脊髓运动神经元胞体一些信号分子的表达变化，通过各种细胞因子激活ERK通路促进细胞存活和抑制细胞凋亡［4］。正常状态下，ERK位于胞浆中，当激活后转位至胞核，调节转录因子活性，例如活化转录因子 AP－1、fas、jun，也参与BCL－2的磷酸化、活化CDK2、CDK4、活化NF－KB诱导生存基因表达，产生细胞效应［5］。因此，研究坐骨神经损伤后，VPA对大鼠脊髓运动神经元p－ERK1／2的表达变化，对研究VPA对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元保护作用机制具有重要意义。

图1 脊髓运动神经元p－ERK1／2免疫组化，＊400

图2 脊髓运动神经元p－ERK1／2定量分析（＊ 对照组比较P＜0.05）

VPA是一种经典的抗癫痫药物，临床使用已有多年，由于其价格便宜，安全性好，受到广大患者的欢迎，一些癫痫病人还长期服用。但是，关于VPA的作用机制却不清楚。本实验结果显示：术后1－28d，VPA实验组相关p－ERK1／2表达明显高于对照组。这些研究结果表明：VPA对脊髓运动神经元的保护作用可能是因为VPA激活了MAPK／ERK信号传导途径，该途径是内源性神经生长因子［6］常用的信号传递系统，该途径亦可调控的基因表达［7］，包括生长相关蛋白（GAP－43）和Bcl－2，促进神经生长和细胞存活。

［1］Waetzig V，Herdegen T.The concerted signaling of ERK1／2and JNKs is essential for PC12cell neuritogenesis and converges at the level of target proteins［J］.Mol Cell Neurosci，2003，24（1）：238.

［2］Bosetti F，Bell JM，Manickam P.Microarray analys is of rat brain gene expression after chronic administration of sodium valproate［J］.Brain Res Bull，2005，65（4）：331.

［3］刘世清，吴 飞，饶 婷，等.丙戊酸对大鼠坐骨神经修复与再生作用的影响［J］.中国临床康复，2005，9（9）：26.

［4］Bonni A，Brunet A，West AE，et al.Cell survival promoted by the Ras MAPK signaling transcription－dependent and independent mechanisms［J］.Science，1999，286（5443）：1358.

［5］Michaela M，Jason EC，Josef A，et al.ERK－dependent and－independent pathways trigger human neural progenitor cell migration［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2007，221（1）：57.

［6］Husseini K，Manji，Gregory J，et al.Clinical and pre－clinical evidence for the neurotrophic effects of mood stabilizers：Implications for the pathophy siology and treatment of manic－depressive illness［J］.Biol Psychiatry，2000，48：740.

［7］Mora A，Gonzalez－Polo RA，Fuentes JM，et al.Different mechanisms of protection against apoptosis by valproate and Li1［J］.Eur J Biochem，1999，266：886.