超声灭活后的国人成骨肉瘤细胞（OS－732）的超微结构变化

潘雪峰，徐长妍，孙新立，葛付涛，牛 丰＊

（1.吉林大学第一医院 脊柱外科，吉林 长春130021；2.吉林大学第一医院 病案室）

随着针对骨肉瘤基础研究的深入和保肢手术治疗的开展，有效灭活骨肉瘤组织成为手术当中最为关键的一环，它直接关系到术后复发、远处转移以及生存率的问题。我们采用超声灭活成骨肉瘤细胞（OS－732），观察灭活后细胞形态和超微结构改变及细胞成活率，为临床应用提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 ①成骨肉瘤细胞（OS－732），购于北京积水潭医院。②超声波细胞粉碎机（JY92－Ⅱ宁波新芝科器研究所 输出功率：0－1000W）。③MTT溶液。④透射电子显微镜等。

1.2 实验方法 OS－732细胞长满单层并处于指数生长期时消化并进行收集分组实验。对照组：未采取任何方法处理。超声灭活组：即采用超声灭活的细胞组。①光镜观察：收集约1×105个细胞，离心后弃上清并用超声灭活，然后用加样器将细胞团吹碎涂于载玻片上，HE染色，在光镜下观察并摄片。②电镜观察：收集约5×108个肿瘤细胞，离心后超声灭活。第一组超声灭活的定时次数为75次；第二组超声灭活的定时次数为150次。工作时间2s，间歇时间2s，输出功率为400W。加入2.5%戊二醛固定。制作超薄切片后在透射电镜下观察。③MTT比色法测定对照组和灭活组细胞活性。

2 结 果

2.1 对照组细胞形态 光镜下细胞主要为多边形、三角形。胞浆轻度嗜碱性，细胞核较大、深染、异形性明显。核染色质较粗，核仁大，核仁1－5个，可见病理分裂相。透射电镜下可分为电子密度较高的“暗细胞”（图1.A）和中等电子密度的“亮细胞”（图1.B）两种类型。细胞核大且不规则；核染色质分布均匀；核仁大，有时可见双核仁；胞质内有大量的粗面内质网和较发达的高尔基复合体及大量分泌泡；线粒体数量较少；还可见多量核糖体及少量溶酶体。细胞表面有非常发达的微绒毛［1］。

2.2 超声灭活组细胞形态

光镜下HE染色后观察，同对照组相比，镜下含有两种主要成分，一种为有形成分，主要以肿瘤细胞为主，可见到未被超声击碎的比较完整的肿瘤细胞，同对照组中的肿瘤细胞无显著差异。还可见到细胞膜被超声击碎的肿瘤细胞，细胞核脱离细胞膜及细胞质，游离在镜下。另一种为无形成分，为被超声击碎的细胞碎片，无任何结构及形态，无法辨认其原始结构。

Fig.1 Ultrastructure features of OS－732cells under normal culture conditions.Cell structure，such as nucleus，chromosome and double pathological nuclears can be cleary seen

透射电镜观察表明，经75次超声灭活后，细胞形态和内部结构同对照组相比出现明显差异。经75次超声作用后，可见镜下含有两种主要成分，一种为有形成分，主要以肿瘤细胞为主，可见到未被超声击碎的比较完整的肿瘤细胞，同对照组中的肿瘤细胞无显著差异。胞核内可见到正常的核仁、核染色质，核膜无明显变化，胞浆内可见到正常的粗面内质网、高尔基氏复合体、线粒体、核糖体、溶酶体、分泌泡等细胞器成分。细胞膜结构无显著变化。还可见到细胞膜被超声击碎的肿瘤细胞，细胞核脱离细胞膜及细胞质，游离在镜下，其结构同对照组的细胞核相比无明显差异。另外还可见到正常的细胞器成分因细胞膜破裂而游离在镜下，其结构同对照组的细胞器相比无明显差异。另一种为无形成分，为被超声击碎的细胞碎片，无任何结构及形态，散在于细胞间，无法辨认其原始结构。击碎的细胞已无法保存其内环境，从而导致不可逆性损伤。（图2.A，图2.B）

Fig.2 Ultrastructure features of OS－732cells treated by ultrasound 75periods.Broken cells and fragment can be seen compared with contrast cells

光镜下HE染色后观察，同对照组相比，镜下主要为无形成分，无法找到具有细胞形态的细胞样结构，均为被超声击碎的细胞碎片，无任何结构及形态，无法辨认其原始结构和来源，同75次超声灭活组中的无形成分相一致。

透射电镜观察表明，经150次超声灭活后，细胞形态和内部结构同对照组和其它灭活组相比出现明显差异。经150次超声作用后，镜下全部为无形成分，无法找到具有细胞形态的细胞样结构和细胞器成分，均为被超声击碎的细胞碎片，无任何结构及形态，无法辨认其原始结构和来源，同75次超声灭活组中的无形成分相一致。细胞已形成不可逆性损伤［1］。（图3.A，图3.B）

Fig.3 Ultrastructure features of OS－732cells treated by ultrasound 150periods.Only cell fragments can be seen compared with contrast cells

2.3 MTT比色法 没有检测到灭活后培养细胞的A值，证明骨肉瘤细胞已经有效地被灭活。

3 讨论

超声属于热灭活肿瘤的一种方法，被认为是最有希望的治疗肿瘤的新方法之一［2，3］。采用超声治疗肿瘤的理论基础之一是认为某些肿瘤较正常细胞对超声更加敏感。在体和离体的实验均表明，超声可以杀灭肿瘤细胞，破坏肿瘤组织，抑制肿瘤组织增殖［2］。特别是近年来以HIFU为代表的高强度聚焦超声（High Intensity Focused Ultrasound，HIFU）治疗体内癌肿装置的改进和对其生物学效应研究的深入，被认为是超声治疗肿瘤的趋势。

3.1 超声灭活骨肉瘤细胞（OS－732）的形态学改变的分析 经超声处理后的OS－732，光镜和透射电镜下观察，主要含有两种成分，一种为有形成分，主要以肿瘤细胞为主，可见到未被超声击碎的比较完整的肿瘤细胞。还可见到被超声击碎的肿瘤细胞，细胞核脱离细胞，游离在镜下。另一种为无形成分，为被超声击碎的细胞碎片，无任何结构及形态，无法辨认其原始结构。75次超声灭活组中两种成份均可见到，而150次超声灭活组中则以无形成分为主，无法找到有形成分，经MTT法检测细胞无任何活性。这充分说明这两种方法能够有效地对骨肉瘤细胞进行灭活，特别是150次超声灭活后细胞被完全击碎，能够更彻底地将肿瘤细胞杀灭。

3.2 超声灭活肿瘤机理的探讨 通过本次实验证实超声能够有效地将肿瘤细胞击碎，故对其抗癌机制的探讨和阐明十分必要。

①热效应 一般认为热机制在超声治疗肿瘤中起主要作用。虽然组织内温度上升受多种因素影响，但却与组织吸收能量成正比，当组织温度升至50－60℃时，由于蛋白质变性，可致生物组织明显变化，表现为凝固性坏死［2－5］。在 HIFU 治疗时，焦域内温度几秒内即可达100℃，而43℃以上足可以致肿瘤细胞不可逆性损伤。

②空化效应 空化作用可致生物组织内自由基产生而损坏生物组织，经超声冲击波和空化联合作用之细胞增殖能力、DNA合成能力均明显低于正常对照组［6］，甚至是细胞被完全击碎，完全找不到正常细胞结构而无任何细胞生物功能。因此，空化效应是超声致死肿瘤过程中又一起主要作用的因素。

③对化学治疗的增强作用 化疗仍是目前恶性肿瘤治疗的重要手段，提高化疗效果和降低其副反应是许多研究想要解决的问题［7－11］。肿瘤细胞内药物的聚集是较为重要的因素之一。细胞膜通透性的增加有助于药物进入细胞内，超声处理能够通过压力波使膜通透性增强，使一些大分子物质进入细胞浆［12］。超声的焦点处即有这种压力，起到这种作用［7］。膜通透性增加的原因还可能与空化效应对细胞膜的损伤有关，特别是使用频率较低超声波时，更易产生空化作用［13］。肿瘤组织DNA修复能力增强是其耐药机制之一［14］。在研究超声对肿瘤细胞DNA合成时的影响时发现，0.5w／cm2和1w／cm2能抑制Ehrlich腹水瘤细胞DNA的合成，而0.1w／cm2则能够刺激DNA的合成，但它对DNA的修复合成（Unschedulated DNA Synthesis）并无明显影响［15］。此既提示采用超声治疗肿瘤需足够的强度，也提示超声治癌并不诱使肿瘤细胞产生对化疗的多药耐药性。

④免疫机制 此机制尚不明确，也正是超声治疗学中亟待阐明的问题。有学者认为是由于高温固化留置瘤苗的作用，一方面，超声破坏癌肿，使瘤／宿主优势得以改善，另一方面，高温使癌组织变性，肿瘤组织抗原性改变，更易刺激机体免疫。肿瘤局部热疗与免疫关系的研究发现，高热可促进肿瘤组织合成热休克蛋白（HSP），HSP可刺激机体免疫系统，提高机体免疫功能［16］。

与此同时，经微波灭活后的保肢术能够保留关节的正常功能，术中减少血行播散和局部扩散，提高患者的免疫功能，从而提高了患者的生存率和生活质量，是目前很好的治疗骨肿瘤的方法。

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