粘质沙雷氏菌几丁质酶ChiA基因的表达及活性分析

张 表，田兴华，罗满林，赵晓瑜

（1.华南农业大学兽医学院，广东 广州510642；2.河南大学生命科学学院，河南 开封475004；3.河北大学生命科学学院，河北 保定071002）

几丁质是由N－乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）单元通过β－1，4糖苷键构成的线性同型多聚体，主要分布在甲壳动物、昆虫的外壳以及真菌的细胞壁中，年产量100～1 000亿t，是自然界仅次于纤维素居第二位的可再生资源［1］。粘质沙雷氏菌具有高效分解几丁质的性质，是外科手术中常见的革兰阴性致病菌［2］。同时，几丁质难溶于水，也不溶于稀酸和稀碱，而其产物几丁寡糖和单体是重要的免疫增强剂且具有极强的抗菌和抗肿瘤活性［5］。几丁质的难溶性以及粘质沙雷氏菌的致病性，长期制约了几丁质的工业化利用。现代生物技术的发展，为彻底解决该瓶颈提供了可能［3］。本试验通过粘质沙雷氏菌几丁质酶的高效表达、纯化及活性分析［4］，为酶法水解几丁质提供了工业化应用前景。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体 粘质沙雷氏菌ATCC27117、E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）均由本实验室保存；载体pBV221质粒由中国科学院生物物理所静国忠教授馈赠。

1.2 主要试剂ExTaqDNA聚合酶、EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶，购自TaKaRa公司。

1.3 目的基因的PCR扩增与纯化 利用软件Primer primier 5.0设计引物。根据 GenBank L01455，几丁质酶基因chiA开放阅读框为1 686 bp。本试验设计的 引物如下：SN：5′GGAATTCATGCGCAAATTTAATAAACCG3′；ASN：5′CGGGATCCAACCGATTATTGAACGCCG 3′。 PCR反应条件：94℃，4min；循环参数：94℃，12s；42℃，10s，72℃，1min；循环数40；最后延伸：72℃，10min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并回收。

1.4 原核表达载体的构建与鉴定 将重组质粒pUC－chiA 和载体pBV221同时进行EcoRⅠ／BamHⅠ双酶切，分别回收目的片段，将目的片段和载体片段在T4DNA连接酶的作用下，于12℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布于含100μg／mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养后挑取阳性克隆。接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇过夜，提取重组表达质粒，经EcoRⅠ／BamHⅠ双酶切鉴定，结果用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，并将阳性克隆测序。鉴定为阳性的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，进行诱导表达。

1.5 目的基因的诱导表达与条件优化 将鉴定的重组菌接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃活化过夜后1%转接于含同样抗生素的LB液体培养基，30℃培养至OD值为0.5左右，42℃诱导表达。分别于诱导前和诱导后3h、5h取菌液，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检查。

1.6 重组蛋白的纯化 诱导表达3h的1L培养液，超声破碎离心后取上清，超滤浓缩为1／10，80%饱和（NH4）2SO4沉淀该蛋白，沉淀溶解在0.02 mol／L磷酸盐缓冲液中（pH值6.0）透析过夜。经几丁质亲和柱层析进一步纯化该蛋白，将纯化产物进行10%SDS－PAGE电泳。

1.7 DNS（3，5－二硝基水杨酸）定糖法测定几丁质酶的活性 NAG标准溶液的配置：准确称取100 mgNAG（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL容量瓶中，定容到刻度，摇匀，浓度为1mg／mL。取9支25×250mm的试管，分别加入 NAG标准液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL，相对应分别加蒸馏水：2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4mL，另外每管加入1.5mL DNS试剂。将各管溶液混合均匀，沸水温浴5min，立即冷却至室温，再向每管加21.5 mL蒸馏水，摇匀，于520nm波长下测OD值。表达产物活性测定如下：取20mL 42℃诱导表达3h的培养液，80Hz，20s／次超声破碎20次，10 000r／min离心1min，取上清备用，2mL上清和23mL 1%几丁质混合液，45℃温育5h，在520nm波长下测OD值。酶活单位定义：在45℃下每毫升酶液每小时释放出相当于1μg NAG的还原糖所需的酶。

1.8 溶圈法测定几丁质酶的活性 在含1%几丁质的LB固体培养基上，取经破壁处理的SM、pBV221／BL21、pBV－chiA5／BL21上清150μL于牛津杯中进行溶圈检测。

2 结果

2.1 原核表达载体的构建与鉴定 经EcoRⅠ／BamHⅠ双酶切的pBV221（3.7kb）插入chiA基因（1.7kb）后，其大小为5.4kb，重组子应比对照迁移率低，挑选5个菌落并提取质粒，1%琼脂糖凝胶电泳，初步表明所得5个转化子明显变大，迁移率变小，分别命名为pBV－chiA1－5（图1）。初步确定为重组子的质粒pBV－chiA5，进行单酶切、双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳分析，出现了一条约3.7kb的pBV221载体线性片段和约1.7kb的目的片段（图2）。酶切片段大小与预期完全相符，PCR产物大小与双酶切小片段相同。测序结果表明，437位碱基由C变为T。

2.2 重组菌的诱导表达及产物纯化 经42℃诱导的重组菌进行SDS－PAGE分析，结果表明，在约58 kDa处有一特异条带，分子量与预期大小一致，不同诱导时间对表达量的影响差别不明显，最佳诱导时间为3h。用软件Alpha Imager2200对表达的蛋白进行薄层扫描分析，表明蛋白表达量约占菌体蛋白的16%，实现了蛋白在大肠杆菌中的高表达。诱导表达3h的1L培养液，经超声破碎、80%饱和（NH4）2SO4沉淀、透析、几丁质亲和柱层析后10%SDS－PAGE电泳，纯化蛋白（图3）较为理想。

2.3 DNS定糖法结果 如表1。

根据表1：重组子△OD值为0.578，SM 的△OD值为0.128，根据公式Y＝0.459x＋0.040计算得相应的坐标点b（1.172，0.578）和点a（0.192，0.128），由酶活定义可知：酶活力＝NAG含量／（上清体积×时间），所以重组子的酶活为117.2μ／mL，SM的酶活为19.2μ／mL。

图3 重组蛋白的SDS－PAGE分析

3.6 溶圈法测几丁质酶活性 SM、pBV221／BL21、pBV－chiA5／BL21经破壁处理，取上清150 μL置于含几丁质（1%）的LB固体培养基上的牛津杯中进行溶圈试验，3d后溶圈现象明显可见。重组菌pBV－chiA5／BL21的几丁质酶活性明显优于粘质沙雷氏菌SM，对照pBV221／BL21基本没有几丁质水解活性（图5）。

3 结语与讨论

3.1 测序结果表明，克隆的chiA基因序列大小为1 686bp，与GenBank中的L01455相比，437位碱基由C变为T，表明该基因在利用几丁质作为碳源或氮源的沙雷氏菌属中较为保守。

3.2 本试验成功构建了原核表达重组质粒pBV－chiA5，该质粒在大肠杆菌BL－21中经42℃诱导后高效表达几丁质酶，表达产物的分子量为58kDa，且主要以可溶性蛋白的形式存在。

表1 不同菌株水解几丁质时吸光度的变化

3.3 本试验采用了饱和（NH4）2SO4沉淀法，几丁质亲和柱层析法纯化了目的蛋白，保证了几丁质酶的活性，为固定化酶批量生产几丁寡糖以及免疫佐剂的开发奠定了基础。

3.4 本试验成功构建了几丁质酶工程菌，其产物活性明显优于粘质沙雷氏菌。蛋白的分离纯化及活性表达对生产蛋白结晶、解析晶体结构、进一步了解几丁质酶作用的分子机制奠定了基础。

［1］Neetu D，Rupinder T，Gurinder S H.Biotechnological aspects of chitinolytic enzymyces：a review［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2006，71：773－782.

［2］Hejazi A，Falkiner F R.Serratia marcescens［J］.J Med Microbiol，1997，46：903－912.

［3］Svein J H，Pawel S，Jannicke B C，etal.Costs and benefits of processivity in enzymatic degradation of recalcitrant polysaccharide［J］.PNAS，2006，103（48）：18089－18094.

［4］Takeshi W，Wataru O，Kazushi S，etal.Chitinase system of Bacillus circulans WL－12and importance of chitinase A1in chitin degradation［J］.Journal of Bacteriology，1990，172（7）：4017－4022.

［5］Riccardo A.A.Muzzarelli.Chitins and chitosans as immunoadjuvants and non－allergenic drug carriers［J］.Mar Drugs，2010，8：292－312.