不同发芽条件对蚕豆植酸酶活性的影响

罗羽洧 解卫华 马 娟 郁志芸

不同发芽条件对蚕豆植酸酶活性的影响

罗羽洧1解卫华2马 娟1郁志芸1

(金陵科技学院园艺学院1，南京 210038)
(环境保护部南京环境科学研究所2，南京 210042)

以蚕豆为试材，研究发芽过程中植酸酶在蚕豆不同部位的变化和性质。发芽蚕豆不同部位植酸酶活性呈现先高后低的变化趋势，子叶植酸酶在发芽第6天达最高值。超声波处理对发芽蚕豆胚根、子叶和胚芽植酸酶活性有一定促进作用，其中以15 min超声波处理对胚根和胚芽植酸酶活性影响最大，5 min处理、10 min处理和15 min处理均对子叶植酸酶活性有显著影响。在发芽过程中不同光照对蚕豆进行处理，不论胚根、子叶还是胚芽，黑暗处理植酸酶活性高于光照处理。核酸抑制剂放线菌素(Act－D)和蛋白质抑制剂环已酰胺(CHM)对发芽蚕豆胚根、子叶和胚芽中的植酸酶活性有一定影响，其中以CHM的抑制效果最为明显。

蚕豆 发芽 植酸酶

植酸酶，又称肌醇六磷酸水解酶，广泛存在于动植物组织和微生物［1－2］。目前分离的植酸酶主要有两种:3－植酸酶和6－植酸酶，前者主要存于动物和微生物;后者主要存于植物组织［3－4］。

蚕豆发芽过程中，植酸酶降解植酸盐，释放出来的无机磷、磷酸肌醇和其他金属离子可供蚕豆生长所用［5－6］。蚕豆中的植酸磷占总磷含量的80%，无机磷在蚕豆发芽过程中起着重要作用，细胞膜合成，DNA和RNA合成都需要无机磷的参与［7］。植酸或植酸盐降解生成的三磷酸肌醇是重要的第2信使，它感应外部环境各种刺激来调节蚕豆的生理反应［8］。同时，植酸盐还结合很多金属离子，如Mg2+、Ca2+等，这些离子在蚕豆发芽过程中也起着重要的生化作用。如Mg2+、Ca2+是很多种蛋白酶的激活剂，同时Ca2+还是生物体内重要的第2信使，这些金属离子只有从植酸盐中释放出来才能发挥作用［9－11］。植酸酶在蚕豆萌发过程中对自身营养成分利用起到重要作用，因此蚕豆植酸酶活性的高低，对蚕豆发芽有重要的意义［12－14］。

蚕豆植酸酶活性受到多种外界因素影响，如温度、pH、发芽时间等。这些因素对植酸酶活性的影响先前已有很多报道［15－17］，如植酸酶的最适温度为50～55℃，最佳pH 5．5，植酸酶活性大小与发芽时间长短有关［15，18－19］。但超声波和光照处理对发芽蚕豆植酸酶活性影响目前没有报道。关于植酸酶的来源，报道的说法不一。研究表明，植酸酶存在于豆科籽粒本身，在发芽过程中被激活发挥作用［20］;另外也有研究表明，籽粒本身不存在植酸酶，豆类作物在发芽过程中，植酸酶来源于从头合成［2］;还有学者认为植酸酶有两种来源［21］。本研究分析了不同发芽条件对蚕豆植酸酶活性的影响，同时就蚕豆在发芽过程中植酸酶的来源做一初步的探讨，为更好利用蚕豆营养价值奠定基础。

1 材料与方法

1．1 供试材料

蚕豆品种为启豆2号，2010年购于南京种业有限公司。

1．2 试验仪器

JA2003型电子天平:上海精密科学仪器有限公司;磁力搅拌器:上海司乐仪器厂;WH－3微型旋涡混合仪:上海沪西分析仪器厂;HH－6型数显恒温水浴锅:常州国华电器有限公司;SK5200L H型超声波清洗器:上海一恒科学仪器有限公司;UV－2802型紫外可见分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1．3 发芽试验和样品处理

选择均匀一致的蚕豆种子用0．5%次氯酸钠消毒25 min，再用去离子水反复冲洗2次。然后放入表面皿中以25℃水浸泡24 h，在25℃条件下发芽8 d。每24 h取样一次，把蚕豆的胚根、子叶、胚芽和胚轴剥开，放在聚乙烯袋中分别保存，然后放置于－18℃冰箱中待测。每天换水、换气2次。每个试验材料设置3个重复［5］。

1．4 植酸酶活性的测定

分别称取5．000 g发芽蚕豆样品，研磨后放入4个100 mL烧杯中(4个重复)，加入50 mL冷却的醋酸缓冲液，用磁力搅拌器搅拌60 min，然后过滤，定容至100 mL，得到植酸酶粗酶液，置于冰箱中低温保存备用。取4支已标号的10 mL刻度试管，其中1管作空白对照，其他3管为反应管。在4支刻度试管中分别加入3．000 mL植酸钠溶液，置于37℃水浴锅预热5 min，然后以相同时间间隔(间隔为0．5 h)依次在反应管中加入已预热的植酸酶溶液1．000 mL，在37℃水浴锅中温育1 h，按与加入酶液相同顺序和时间间隔加入4．000 mL钒钼酸铵显色/终止液，空白管加入1．000 mL植酸酶溶液，混合摇匀，用分光光度计在415 nm处比色(以空白管作对照)读取吸光度，代入标准曲线计算植酸酶活性。每分钟水解释放1μmol无机磷为1个活性单位(1 u)。

1．5 超声波处理

超声波处理:用蒸馏水浸泡蚕豆24 h，然后将各处理蚕豆样品用纱布包裹，悬于超声波清洗器水槽中，按规定时间准确处理，介质为16～18℃蒸馏水。放入SK5200L H型超声波清洗器(工作频率59 kHz，功率200 W)中进行处理，每个处理3个重复，每个重复50粒种子。处理时间:对照:0 min，处理1∶5 min，处理2∶10 min，处理3∶15 min，处理4:20 min［22］。

1．6 光照处理

设置两个光照处理类型。光照处理:12 h光照+12 h黑暗;黑暗处理:24 h黑暗处理。

1．7 核酸抑制剂和蛋白质抑制剂处理

药剂吸胀处理:处理方法基本同上，仅在种子吸胀阶段进行如下处理:分别在50 mg/L Act－D(放线菌素，核酸合成抑制剂)和20 mg/L CHM(环己酰亚胺，蛋白质合成抑制剂)溶液中吸胀。吸胀处理24 h后，倾去多余溶液继续在暗中萌发。萌发120 h后检测胚根、子叶和胚芽植酸酶的活性［23］。

2 结果与分析

2．1 植酸酶在发芽蚕豆不同部位的分布特点

从图1可看出，胚根植酸酶活性在发芽前5天是逐渐增加，发芽第5天达到最大峰值170．2 u/g。从第6天开始，蚕豆植酸酶活性逐步降低，但酶活性仍比发芽前4天要高。

图1 植酸酶活性在胚根中含量的变化

从图2的结果可以看出，子叶中植酸酶活性大于胚根中的活性(P＜0．01)。子叶在刚开始发芽的时就具有一定的酶活，随发芽时间的延长，植酸酶活性增加显著，但发芽到第5天达到酶活性峰值，随后逐步下降。植酸酶活性在子叶和胚根中的变化类似。

图2 植酸酶活性在子叶中含量的变化

图3 表示胚芽中植酸酶活性的变化情况。胚芽中植酸酶活性变化蚕豆的发芽阶段变化平缓，发芽第6天达到酶活性的高峰，然后缓慢下降。值得注意的是，胚芽在发芽的初期就具备一定酶活性，这与子叶的情形很相似，因此可推断，在胚芽和子叶中本身就存在一定含量的植酸酶，浸泡处理可激活植酸酶而表现出一定活性，这与胚根中植酸酶来源不同，胚根中植酸酶活性可能来至于新合成植酸酶或来至从子叶运输过来的植酸酶。

图3 植酸酶活性在胚芽中含量的变化

图4表示蚕豆胚轴中植酸酶活性的变化情况。胚轴植酸酶活性变化趋势是逐渐减少，在发芽的第4天就基本检测不来。

图4 植酸酶活性在胚轴中含量的变化

2．2 超声波处理对发芽蚕豆植酸酶活性的影响

图5～图7表示超声波处理对发芽蚕豆胚根、子叶和胚芽植酸酶活性的影响。从图5可以看出，处理1、处理2和处理3对发芽蚕豆胚根植酸酶活性有激活作用，并且差异显著(P＜0．05)，其中以处理3的效果最好，但是处理1、处理2和处理3之间差异不显著(P!0．05)。从图6可以看出处理1、处理2和处理3均对子叶植酸酶的活性有显著影响(P＜0．05)，而处理4和对照相比，差异不显著(P!0．05)。但是处理1、处理2和处理3之间差异不显著(P!0．05)。这和胚根中植酸酶的情况类似。图7可以看出处理1、处理2和处理3均对胚芽植酸酶的活性有显著影响(P＜0．05)，与处理4相比差异显著(P＜0．05)。

超声波是频率大于20 kHz的机械振动在介质中传播的弹性波，能在介质中引起空化效应，热效应和机械效应，适当强度的超声波作用于生物组织，将会活化生物物质，调节新陈代谢，最终表现出人们预期的生物学效应［24－25］。近年来有研究发现，适当强度超声波处理可增强细胞膜的透性，促进生物酶的催化活性。一般认为较低的超声波功率对酶起激活作用，大功率的超声波会让酶失活。超声波对一种酶的酶促反应究竟有何影响，要看不同的参数和试验条件而定，并不能一概而论［26－27］。

图5 超声波处理对发芽蚕豆胚根植酸酶活性的影响

2．3 光照处理对发芽蚕豆不同部位植酸酶活性的影响

从图8～图10中可以看出，不论是在胚根、子叶还是胚芽，黑暗处理发芽蚕豆植酸酶的活性高于光照处理。说明光照对植酸酶活性有一定影响。国外有学者利用不同类型的光对大豆发芽过程中植酸酶的活性进行研究，结果发现，光量子能量越大，植酸酶活性越小，光量子能量越小，植酸酶的活性越大。说明光能量大小对植酸酶的活性有影响，究竟是影响其空间结构还是影响其与底物接触还有待于进一步研究［28］。

图8 光照和黑暗处理对发芽蚕豆胚根中植酸酶活性的影响

2．4 核酸抑制剂和蛋白质抑制剂对发芽蚕豆植酸酶活性的影响

从图11可看出，不论是核酸抑制剂(Act－D)还是蛋白质抑制剂(CHM)都对发芽蚕豆胚根、子叶和胚芽中的植酸酶活性有一定影响，其中以蛋白的抑制效果最为明显(P＜0．05)，发芽5 d后，蛋白质抑制剂处理的蚕豆中胚根、子叶和胚芽中植酸酶活性只相当于对照处理的24．9%、34．5%和26．7%。从这个结果我们可以看出，在蚕豆种子发育成熟候，mRNA在种子内已形成并贮存在蚕豆种子中，在种子发芽的时进行翻译合成植酸酶蛋白质。但这部分的mRNA并不是蚕豆种子中植酸酶蛋白质的全部，核酸在发芽过程中同样要转录形成部分的mRNA来形成更多的植酸酶供种子发芽时所需。在国外也有相关的报道［29］。台湾大学有报道表明，在大麦发芽过程中，观察到了新植酸酶蛋白质谱带，这说明有新的植酸酶蛋白质在发芽过程中合成［21］。因此可推断，蚕豆种子萌发和植酸酶有密切的关系。也有研究证明，植酸酶水解植酸产生的肌醇三磷酸(简称IP3)可作为信息传递体打开细胞器的钙通道，活化生长素受体因子，形成蛋白质—生长素复合物，活化核内特殊mRNA，进而生成发芽所需要的酶类［3，8，30］。蚕豆种子萌发需要大量磷元素参与，并且蚕豆中80%的磷元素存在于植酸中，植酸能否顺利降解对于蚕豆的发芽至关重要。

图11 Act－D和CHM对发芽蚕豆不同部位植酸酶活性的影响

3 结论

发芽蚕豆不同部位植酸酶活性呈现先高后低的变化趋势。超声波处理对发芽蚕豆胚根和子叶植酸酶活性有一定的影响，其中以处理3对胚根植酸酶活性影响最大，处理1、处理2和处理3均对子叶植酸酶活性有显著影响。在发芽过程中用不同的光照对发芽蚕豆进行处理，不论是在胚根、子叶还是胚芽，黑暗处理植酸酶的活性高于光照处理。核酸抑制剂(Act－D)还是蛋白质抑制剂(CHM)都对发芽蚕豆胚根、子叶和胚芽中的植酸酶活性有一定影响，其中以蛋白质抑制剂的效果最为明显。

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Effects of Different Germination Conditions on Phytase Activity on Faba Bean(Vicia faba L．)

Luo Yuwei1Xie Weihua2Ma Juan1Yu Zhiyun1
(College of Horticulture，Jinling Institute of Technology1，Nanjing 210038)
(Nanjing Institute of Environmental Science of Ministry Environmental Protection2，Nanjing 210042)

Phytase activity and property in different faba bean fractions during germination were investigated with faba bean as the testing piece．The phytase activity appeared a change trend of increasing first then decreased with the maximum value at the sixth day during germination in cotyledon．Ultransonic treatments had facilitations on dles．Singel factor experiment was made to modified potato starch，early indica rice flour，water content and scope of steaming time．Carry out the orthogonal experiment with millet rice noodles index weight springiness 0．2，chewiness 0．2，stretchability 0．3，sensory score 0．3，workability 0．3 as the evaluating index of millet rice noodles quality．The test shown the peocessing conditions of millet rice noodles:salt content was 0．4%;sodium pyrophosphate was 0．03%;modified potato starch content was 12%;early indica rice flour was 8%;water content was 60%and steaming time was 6min．And at these conditions，comprehensive evaluation score was 67．205，in whick the sensory score was 8．7，tasting better and noodle gloss better．Then the processing of millet rice noodles was predicted to have certain feasibility．

millet，millet rice noodles，texture properties，processing conditions

TS275．4

A

1003－0174(2012)10－0032－06

江苏省高校自然科学基金(11KJD210001)，金陵科技学院博士科研启动基金(jit－b－201205)

2012－01－02

罗羽洧，男，1978年出生，副教授，博士，园艺产品贮藏与加工