玉米秸秆水解液发酵产微生物油脂动力学研究

冯 冲 李领川 赵国欣 董彩霞 李建新 华慧颖

玉米秸秆水解液发酵产微生物油脂动力学研究

冯 冲1李领川1赵国欣1董彩霞2李建新2华慧颖2

(中州大学实验管理中心1，郑州 450044)
(中州大学化工食品学院2，郑州 450044)

对发酵性丝孢酵母在玉米秸秆水解液中发酵合成微生物油脂动力学特性进行了研究。采用Logistic菌体生长模型、Luedeking－Piret模型和产物生成的基质消耗模型，描述了完整发酵过程的动力学特性，提出了发酵过程中菌体生长、微生物油脂合成、基质消耗的动力学模型。采用牛顿迭代法对模型参数进行非线性拟合，结果表明，模型计算与试验数据能较好地拟合，菌体生长、产物油脂生成及糖分消耗等3条曲线的相关指数R2分别为0．990、0．987和0．890。表明该动力学模型可以较好描述发酵性丝孢酵母发酵过程的动力学特征。

玉米秸秆 发酵 生物油脂 动力学模型 参数估计

秸秆是地球上丰富的可再生资源。据联合国粮农组织统计，世界秸秆年产量为20～30亿t，中国每年农作物秸秆产量约7亿t，占全世界秸秆总量的20%～30%［1］，其中玉米秸秆、小麦秸秆和稻秆占75%以上。一些产油微生物能够有效利用各种农林废弃物及工业和农副产品下脚料，直接转化为微生物油脂，再进一步转化为生物柴油，这样不但可以使废弃物得到合理的利用，同时又开辟了一条清洁能源再生途径。目前利用玉米秸秆发酵生产生物油脂已有报道，莫夏迪等［2］发现粘红酵母有较强的生长适应能力，能在不添加其他任何营养物质的高粱秸秆汁里很好的生长，并且能达到生物量16．73 g/L，油脂含量22．73%。潘丽霞等［3］利用蔗渣半纤维素水解物发酵产油，油脂得率系数分别为13．49和10．23，显示了利用蔗渣这种廉价原料生产微生物油脂的潜力。冯冲等［4］对玉米秸秆稀酸水解液的脱毒后发酵产脂条件进行了优化，菌体生物量达21．2 g/L，油脂含量为50．9%。沈珺珺等［5］研究了产油酵母菌皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)利用经过简单脱毒处理的大米草水解液，直接发酵生产微生物油脂，产油量最高达6．0 g/L。里伟等［6］以一株高产油脂圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidum toruloides Y4#)干菌粉为原料，分别研究了无溶剂体系中三步甲醇法及在叔丁醇介质体系中脂肪酶催化合成微生物柴油，其得率可达90%左右。但玉米秸秆发酵产微生物油脂的动力学特性研究还未见报道。发酵动力学是用数学模型定量描述发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律［7］，是工业放大过程中设计、操作和模拟优化的基础。建立动力学模型并对发酵过程的数据进行分析有助解决工业化生产中将会遇到的许多问题。本试验采用实验室自行筛选的高产油脂菌株IFFI01368，对玉米秸秆水解液发酵产生物油脂动力学特性进行了研究。

1 材料与方法

1．1 材料

发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)IFFI01368购自中国食品发酵工业研究院。

玉米秸秆(郑州郊区)切割粉碎30～40目。

商品木聚糖酶及纤维素酶产品购于上海杰能科酶制剂公司，其中木聚糖酶酶活1．76×106u/mL，纤维素酶酶活2．07×106u/mL。

发酵产脂培养基配制方法见文献［8］。

1．2 试验方法

1．2．1 玉米秸秆水解液的制备

每300 mL的三角瓶中称取10 g玉米秸秆粉，在浓度为1%的稀硫酸，121℃条件下预处理60 min后，加入蒸馏水并调整到pH 5．0，液固比为10∶1，MgCl2为2．5 nmol/L，吐温80为1．5 mL/L，加入纤维素酶2．5 g/100 g和木聚糖酶液2 mL/100 g，在50℃的条件下糖化48 h，经普通滤纸过滤得水解糖化液。测得玉米秸秆的总还原糖浓度为(5．0±0．3)%，经测定葡萄糖和木糖占总还原糖的(87±2)%［9－10］。在水解糖化液中，补加4%的蔗糖，pH 5．5，300 mL三角瓶盛装玉米秸秆水解液50 mL，分装，包扎，灭菌［8］。

1．2．2 种子液的制备

从活化的IFFI01368斜面挑取适量菌种，接入盛装50 mL种子液培养基的300 mL三角瓶中，进行震荡培养22 h，温度27℃，转速150 r/min。

1．2．3 发酵产脂培养

分装后的玉米秸秆水解液121℃灭菌20 min，然后将种子液按10%的接种量转接于秸秆水解液中进行产脂发酵培养，条件为150 r/min，27℃，4 d。发酵过程中，每6 h取出3个三角瓶，测定菌体生物量，油脂含量及总糖含量。

1．2．4 分析测定方法

总糖含量测定:3，5一二硝基水杨酸(DNS)法［11］。

木糖含量测定:地衣酚法［12］。

菌体生物量的测定:通过4 500 r/min离心10 min，收集菌体并干燥(干燥温度80℃)至衡重，准确称取干菌体量。

生物量(DW)=干菌体/发酵液

油脂抽提:精确称取一定量粉碎后的干菌体，每克干菌体添加40 mL盐酸水解法，室温下静置20 min，沸水浴加热10 min，加入适量氯仿 － 甲醇(2∶1，体积比)，振荡30 min，然后在4 500 r/min下离心15～20 min，分液，取氯仿层，真空干燥除去氯仿即得油脂，计算油脂得率［13］。

油脂含量=粗油脂质量/菌体干重×100%油脂浓度=粗油脂质量/发酵液体积

1．3 模型建立

1．3．1 菌体生长动力学模型

菌体生长动力学最常用方程有Monod方程和Logistic方程。由于Monod方程是理想化模型有一定的局限性，而Logistic方程是一个典型的S型曲线，能很好地反映发酵过程中普遍存在的菌体浓度增加对自身生长的抑制作用［14］。所以采用Logistic方程构建菌体生长动力学模型较为合适，Logistic方程为:

式中:k最大比生长速率;Co初始菌体质量浓度/g/L，本试验中Co=5．3 g/L;初始条件t=0时，菌丝体浓度Cx等于接种后的菌丝体Co;Cx菌体质量浓度/g/L;CM最大菌体质量浓度/g/L。

1．3．2 油脂生成动力学模型

由酵母油脂发酵试验结果及相关文献［15］可知，油脂的合成与菌体生长为偶联型，可以用Luedekingpirets方程来描述这一规律。即有:

式中:m1，m2为模型参数，Cx为菌体质量浓度/g/L;P0为初始油脂含量，初始条件t=0时P0=0;P为油脂质量分数/%。

1．3．3 底物消耗模型

菌体发酵过程中，底物的消耗一方面用于菌体的生长，另一方面则用于产物的合成及其代谢，因此，底物消耗速度可由下式表示:

式中:Cx为底物糖浓度/g/L;Yx/s为对底物菌体的得率系数，g(菌体干重)/g(糖分);ke为细胞维持常数，g糖分/g(菌体干重)/h;Yp/s对底物产物的得率系数，g(产物)/g(糖分)。系数将为正值。S0为初始糖浓度，初始条件t=0时，S=S0=86．0 g/L;S(t)为时间t时的底物糖质量浓度/g/L。

1．4 数据处理

使用Excel 2000中的规划求解对积分方程进行分析处理计算，通过牛顿运算法则，经过100次迭代，使试验值和方程式预测值之间的误差平方和SSE趋于最小。

2 结果与分析

2．1 产脂发酵过程

图1 发酵过程菌体生物量、底物总糖浓度和产物油脂含量的变化

图1 为玉米秸秆水解液发酵过程中菌体生长、底物还原糖浓度和产物油脂含量随时间变化的代谢曲线。由图1可以看出，发酵前30 h，菌株处于生长延迟期，耗糖速率较低，菌体生物量，油脂含量缓慢增加。30 h之后，菌体进入对数生长期，生长速度逐渐加快，同时产物油脂生成速率加快，对应着底物糖分的消耗。到78 h左右，进入菌体生长稳定期，底物糖分基本耗尽，产物油脂变化很小，说明发酵周期可以控制在78 h之内。在发酵后期，由于基质糖分基本耗尽及发酵液中有毒物质的作用，菌体死亡率上升，同时油脂含量降低，说明菌体可能在糖分耗尽后又开始以自身油脂作为碳源和能源。

2．2 发酵动力学模型

2．2．1 菌体生长动力学模型

对方程(1)积分可得生物量(Cx)与时间(t)函数:

将模型参数代入方程(2)中，求得发酵过程中菌体生长动力学模型如下:

图2 发酵过程菌体生物量模型计算值与试验值比较

图2 中菌体生物量试验值和模型拟合值的相关系数R2=0．990，说明此模型能够很好地描述菌体在发酵过程中的生长情况。

2．2．2 油脂生成动力学模型

将方程(1)代入方程(4)得:

将方程(2)代入方程(4)得积分方程(6):

将模型参数代入方程(6)中，求得发酵过程中产物的生成动力学模型(7):

图3 发酵过程产物油脂含量模型计算值与试验值比较

图3 中菌体产脂试验值和模型拟合值的相关系数R2=0．987，说明此模型能够很好地描述菌体在发酵过程中的油脂积累情况。

2．2．3 底物消耗模型

将方程(1)、方程(4)代入方程(8)可得:

将b1，b2代入积分得:

图4 发酵过程底物还原糖浓度模型计算值与试验值比较

图4 中菌体还原糖质量浓度试验值和模型拟合值的相关系数R2=0．890，说明此模型能够较好地描述菌体在发酵过程中的生长及产脂情况。

2．3 参数估计

综合以上3部分动力学分析结果，经过拟合的动力学参数如表1所示。

表1 发酵动力学模型参数

参数估值拟合结果如表1和图2～图4所示，采用相关指数R2来考察拟合效果，得到菌体生长、油脂生成、糖分消耗等3条曲线的相关指数R2分别为0．990、0．987和0．890。由此可以看出，前两者拟合效果很好，而糖分消耗拟合效果稍差，可能是由于在稀酸水解过程中会生成对酵母细胞的生长和代谢有抑制作用的毒性物质，例如甲酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛、糖醛酸、己糖酸等，影响了细胞对糖分的吸收。

3 结论

根据菌株IFFI01368发酵试验数据，建立了玉米秸秆水解液发酵产脂过程的动力学模型，描述了菌体生长、产物油脂形成和底物糖分消耗变化的整个过程，采用牛顿迭代法对模型参数进行了非线性拟合。结果表明，菌体生长、油脂生成、糖分消耗等3条曲线的相关指数R2分别为0．990、0．987和0．890。由表1和图1～图4可以看出，其拟合良好，所建立的模型较好地反映了玉米秸秆水解液发酵代谢过程基本特征及其动力学机制，可用于进一步设计大型发酵工艺。

［1］陈合，张强．菌酶共降解玉米秸秆的工艺研究［J］．农业工程学报，2008，24(3):270－272

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［3］潘丽霞，杨登峰，邵利，等．利用蔗渣半纤维素水解液产油酵母的筛选、鉴定及发酵实验［J］．微生物学通报，2008，35(8):1176－1181

［4］冯冲，王艳颖，康静，等．发酵性丝孢酵母产油脂中纤维质糖化液脱毒工艺对比及优化研究［J］．北京化工大学学报:自然科学版，2011，38(3):87－91

［5］沈珺珺，李富超，杨庆利，等．皮状丝孢酵母利用大米草水解液发酵生产微生物油脂［J］．海洋科学，2007，31(8):38－41

［6］里伟，杜伟，李永红．生物酶法转化酵母油脂合成生物柴油［J］，过程工程学报，2007，7(1):137－140

［7］李艳．发酵工业概论［M］．北京:中国轻工业出版社，1999

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［10］Barber A R，Hansson H，Pamment N B．Acetaldehyde stimulation of the growth of saccharomyces cerevisiae in the presence of inhibitors found inlignoce1lu1ose－to－ethanol fermentations［J］．Journal of Industrial Microbiology，2000，25(2):104－108

［11］李稳宏，吴大雄，高新，等．麦秸纤维素酶解法产糖预处理土艺条件研究［［J］．西北大学学报:自然科学版，1997，27(3):227－230

［12］冯冲．高纯度生物柴油原料的微生物转化技术研究［D］．河南:河南农业大学，2007

［13］曹健，汪晨辉，曾实，等．卷枝毛霉Mucorcircinelloides3．2208油脂几种提取方法的比较［J］．中国油脂，2004，27(4):38－40

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Dynamics Study on Microbial Oils Production by Corn Straw Hydrolysate Fermentation

Feng Chong1Li Lingchuan1Zhao Guoxin1Dong Caixia2Li Jianxin2Hua Huiying2
(Experimental Management Centre，Zhongzhou University1，Zhengzhou 450044)
(College of Chemical Engineering and Food Science，Zhongzhou University2，Zhengzhou 450044)

We performed research on dynamics speciality that using fermentation of the trichosporon fermentans into corn straw hydrolysate to synthetize microbial oils．The dynamics speciality of complete fermentation process was described based on Logitstic thallus growth model，Leudeking－Piret model and matrix consumption model that the product generated and dynamics models of thallus growth during fermentation，microbial oils synthesis and matrix consumption was also described．The parameters in the models were nonlinear fitting through Newton iterative method．The results showed that the predicted value by the dynamics models could fit well with the experimental data，and the relative index R2of the thallus growth，product lipid generating and sugar consumption were 0．990，0．987 and 0．890 respectively．The results also indicated that the dynamics models could better describe dynamics features of the process of trichosporon fermentans．

corn straw，fermentation，lipid，dynamics model，parameter estimation

Q936;S37

A

1003－0174(2012)10－0013－05

河南省教育厅2011自然科学基金(2011C1 80001)，郑州市科技局2010年自然科学基金(10PTGG345－3)

2012－02－09

冯冲，女，1970年出生，讲师，生物能源工程

华慧颖，女，1972年出生，副教授，生物能源和动物遗传