化学预处理对芦苇酶解糖化的影响

朱作华，蔡侠，严理，胡镇修，李智敏，彭源德

(中国农业科学院麻类研究所，长沙410205)

生物乙醇是最有希望取代化石燃料用于交通运输的燃料，利用丰富而廉价的木质纤维素资源代替粮食生产燃料乙醇已经受到了越来越多的关注。酶水解条件温和、无污染、副产物少，是最有前景的纤维素降解方式，但由于木质纤维素本身的理化特性及结构组成的复杂性，酶有效降解纤维素前必须经过预处理过程［1］。目前，比较有效的预处理方法包括利用酸、碱或者水作为催化剂在较高的温度或压力下进行处理［2－4］。酸预处理能够溶解掉半纤维素，但易产生副产物;碱预处理或许可以更有效的去除掉木质素，但半纤维素可能变为难溶的聚合物;生物法也可以取得良好的预处理效果，但处理时间较长［5－7］。显然，选择什么样的预处理过程，需要考虑原料的种类(木本、草本植物或者农业残渣)、组分等，也要考虑五碳糖利用等问题，灵活的预处理技术能使原料得到更充分利用［8］。

芦苇(Phragmites australis)是多年生草本植物，主要生长在温带和热带的湿地，具有重要的生态功能［9］。芦苇分布广泛、适应性强、生长快、产量高，不需要施肥，全世界种植面积约有1000万公顷，我国现有14个芦苇主产区，宜苇面积130万公顷以上［10，11］。目前，芦苇在农村主要用于牲畜的草料和草垫等，工业上主要用作造纸原料。芦苇的产量和质量主要取决于当地的生长条件，每公顷干茎产量15－35吨，茎杆纤维素含量40%以上，半纤维素含量30%左右，用于燃料乙醇生产前景十分可观，是一种很有潜力的可再生能源植物［9，10］。

目前，对芦苇加工方面的研究主要针对芦苇制浆［11，12］，作为能源植物只有少数进行湿式氧化预处理研究［9］。本研究对芦苇进行稀硫酸、氢氧化钠等预处理技术研究，对预处理及酶糖化效果进行了比较分析，以期获得适合芦苇高效糖化的预处理方法。

1 材料与方法

1.1 材料

芦苇取自益阳市沅江洞庭湖区，经自然风干后剪碎。

1.2 试验方法

1.2.1 芦苇化学组分分析

芦苇的化学组分直接影响芦苇预处理效果及酶解糖得率，试验采用常规理化分析方法对芦苇主要成分进行分析。

1.2.2 稀硫酸预处理

1.2.2.1 稀硫酸浓度对芦苇酶糖化的影响

称取10g芦苇原料，放入300ml三角瓶中，分别加入一定量0.0%(对照，不经预处理直接酶解)、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%(v/v)的 H2SO4溶液，120℃反应 60min，调 pH 值 5.0，并用蒸馏水调成浴比1:15，然后进行酶解处理。

1.2.2.2 稀硫酸预处理正交试验

在稀硫酸浓度试验的基础上，应用正交试验设计优化影响稀硫酸预处理效果的主要工艺，进行三因素三水平9组试验，三因素为稀硫酸浓度(A)、反应时间(B)、反应温度(C)，试验设计表如表1

表1 稀硫酸正交试验因素及水平Tab.1 Factors and levels of the H2SO4orthogonal tests

1.2.3 氢氧化钠预处理

1.2.3.1 氢氧化钠浓度对芦苇酶糖化的影响

称取10g芦苇原料，放入300ml三角瓶中，加入浓度分别为0.0%(对照)、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(w/v)的 NaOH 溶液，120℃反应60min，pH 值为5.0，并用蒸馏水调成浴比1:15，然后进行酶解。

1.2.3.2 氢氧化钠预处理正交试验

在氢氧化钠浓度试验的基础上，应用正交试验设计优化影响氢氧化钠预处理效果的主要工艺，进行三因素三水平9组试验，三因素为氢氧化钠浓度(A)、反应时间(B)、反应温度(C)，试验设计表如表2。

表2 NaOH正交试验因素及水平Tab.2 Factors and levels of the NaOH orthogonal tests

1.2.4 几种预处理方法的比较

选择优化后的几组预处理条件，进行比较分析，预处理方式如表3。

表3 不同方法预处理实验条件Tab.3 Factors and levels of different pretreatments

1.2.5 酶解

加入10%纤维素酶和5%木聚糖酶，于恒温摇床中45℃，180rpm酶解糖化24h，糖液用于分析。

1.3 分析方法

1.3.1 糖化液分析

预处理及酶水解所得的糖化液，还原糖含量用DNS法测定［13］。

1.3.2 计算

预处理糖化率(%)=预处理液还原糖总量(g)/原料重量(g)×100%

酶解糖化率(%)=酶解液还原糖总量(g)/原料重量(g)×100%

2 结果与分析

2.1 芦苇化学组分分析

由表4可以看出，芦苇中纤维素和半纤维素含量占75.96%，纤维素和半纤维素在一定条件下能降解为可发酵糖，是一种优良的乙醇生产原料。由于芦苇的半纤维素含量达35.36%，因此作为乙醇生产原料，五碳糖的利用也很有必要。

表4 芦苇组分分析Tab.4 Component analysis of reed

2.2 稀硫酸预处理

2.2.1 稀硫酸浓度对芦苇预处理及酶糖化的影响

图1 硫酸浓度对芦苇糖化的影响Fig.1 The effect of sulfuric acid concentration on reed saccharifaction

由图1可以看出，添加硫酸进行预处理后，芦苇的预处理糖化率与酶糖化率均得到了大幅度的提高。硫酸浓度为0.5% －2.0%(v/v)之间时，预处理液和酶糖化液还原糖浓度随着硫酸浓度的增加呈增加的趋势;酸浓度为2.0－4.0%(v/v)时，预处理液还原糖浓度略有增加，但酶糖化液还原糖浓度反而降低;当酸浓度为4.0% －6.0%(v/v)时，预处理液和酶糖化液还原糖浓度均降低;原因可能为，稀硫酸对半纤维素有良好的水解作用，对纤维素也有一定的降解作用，但当稀硫酸超过一定浓度后，会造成部分单糖的变性，产生某些抑制酶糖化的物质［1，14］，因此，预处理硫酸浓度以0.5% －2.0%(v/v)范围较为合适。

2.2.2 稀硫酸预处理芦苇正交优化试验

表5 稀硫酸预处理正交试验结果与分析Tab.5 Design and results of orthogonal tests in dilute H2SO4solutions

表5极差分析结果显示，3个因素对芦苇预处理及酶解糖化率的影响程度依次为C＞A＞B，说明反应温度是最重要的影响因素。方差分析显示，在α=0.1水平上，反应温度对芦苇预处理及酶解糖化率有显著影响，反应时间与硫酸浓度影响不显著。根据正交试验结果以及考虑酸对容器的腐蚀性、降低化学试剂的用量，减少抑制物的产生，优化的稀硫酸预处理组合为A2B2C3，即硫酸浓度 1.0%(v/v)，反应温度 120℃，反应时间 1.0h。

2.3 氢氧化钠预处理

2.3.1 NaOH浓度对芦苇预处理及酶解糖化的影响

由图2可以看出，NaOH预处理液中还原糖含量很低，还原糖浓度均在1mg/ml以下，预处理后的芦苇加酶降解，酶解液还原糖浓度及酶解糖化率有大幅度的提高。NaOH浓度在0.5% －1.5%(w/v)时，随着NaOH浓度的增加，酶解还原糖浓度及糖化率呈增加的趋势，NaOH浓度为1.5%(w/v)时达到最大，随后开始略有降低，因此，NaOH浓度以1% －2%(w/v)较为合适。

图2 氢氧化钠浓度对芦苇糖化的影响Fig.2 The effect of sodium hydroxide concentration on reed saccharifaction

2.3.2 NaOH预处理芦苇正交试验

表6极差分析结果显示，与硫酸预处理相比，3个因素对芦苇酶解糖化率的影响程度依次为C＞A＞B，反应温度是最重要的影响因素。优化的组合为A2B2C3，即NaOH浓度1.5%(w/v)，反应温度120℃，反应时间1.0h。

表6 NaOH预处理正交试验结果与分析Tab.6 Design and results of orthogonal tests in NaOH solutions

2.6 几种预处理方法的比较分析

由图3可以看出，与对照相比，3种预处理方式均能在一定程度上提高芦苇预处理糖化率及酶解糖化率，从酶解糖化率来看，NaOH法＞稀H2SO4法＞热水法＞对照，NaOH预处理后酶解糖浓度增幅最大，增加了近10倍，说明经氢氧化钠预处理后的芦苇更容易被酶降解，原因可能为NaOH预处理能较好的破坏木质素内部结构，从而使得纤维丝从木质素的包裹中释放出来［15，16］，有利于酶解作用，也表明与稀H2SO4法相比，芦苇预处理更适宜的方法为NaOH法。

图3 不同预处理方法的比较分析Fig.3 Comparison among different pretreatments

3 小结

本研究采用的3种预处理方法均能在一定程度上提高芦苇的可降解性，其中稀硫酸预处理工艺为1%H2SO4(v/v)、120℃、处理1h;NaOH 法预处理工艺为1.5%NaOH(w/v)、120℃、处理1h。

从预处理糖化率来看，稀硫酸预处理效果较好;而从酶解糖化效果来看，NaOH法效果更好，酶解糖化率NaOH法＞稀H2SO4法＞热水法＞对照，经NaOH预处理后，酶解酶解还原糖浓度大幅增加，芦苇酶降解糖化率可达65.2%，这也表明NaOH法预处理后的芦苇，更有利于酶的降解。

总体来说，芦苇预处理，NaOH法是一种较好的方式，是否有更有效的预处理方法如汽爆预处理等还有待进一步研究，预处理及酶解糖化液的糖组分也还有待进一步分析。

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