MPEG-PLGA纳米胶囊在真核质粒转染细胞中的应用

涂心明，郭绍芳，胡伊乐

基因治疗是近些年来兴起的通过植入外源性治疗基因片段，治疗各种基因缺陷性疾病的一种新型疾病治疗方法。基因治疗时需将治疗性目的基因片段插入真核质粒并转入机体细胞，通过目的基因在体内的表达纠正某些基因缺陷，以达到治疗疾病的目的[1]。由于大多数治疗用真核质粒携带负电荷与细胞膜自身电荷相同，静电排斥作用使自然情况下裸质粒穿越细胞膜的几率较低，很难达到治疗浓度[2]。为增加真核质粒穿越细胞膜的几率，目前常用的方法有增加细胞膜通透性的氯化钙、电击、基因枪等方法[3]，由于对机体细胞有损伤，多用于实验研究，临床应用较少。MPEG-PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)是一类可降解的功能高分子有机聚合物, 通过美国 FDA认证, 具有良好的生物相容性、无毒、无刺激性、无免疫原性和药物缓释等特性[4], 在临床与科研中作为化学类药物的给药载体得到广泛应用，作为真核质粒的跨膜转运载体的研究，目前文献报道较少。本实验利用MPEG-PLGA包裹绿色荧光真核质粒，通过绿色荧光蛋白在细胞内的表达验证其作为真核质粒跨膜载体的可行性。

1 材料与方法

1.1材料MPEG-PLGA购自山东济南岱罡生物技术有限公司；四季青胎牛血清、DMEM培养基购自上海宝生物生物有限公司；pEGFP-C3绿色荧光真核质粒与NIH3T3细胞由河南科技大学医学院人体解剖学实验室保存；6孔细胞培养板、冻存管购自郑州天根生物有限公司。

1.2方法

1.2.1 溶液的配制 ①MPEG-PLGA水溶液的制备：用三角瓶取双蒸水20 mL，牛皮纸封口后高温蒸汽消毒，待自然冷却后置4℃冰箱过夜以备用，无菌环境下称取MPEG-PLGA 300 mg，加入已消毒的4℃双蒸水中，将三角瓶置于冰水混合物中震荡使其溶解。待溶解完全后，置4℃冰箱保存备用。②MPEG-PLGA/DNA纳米胶囊复合物的配制：取260 pg/mL的质粒300 μl加入到1 mL上述配制的MPEG-PLGA溶液中在冰水混合物中混匀，在此过程中尽量轻柔以防止破坏质粒结构，室温放置15 min，置37℃恒温箱中30 min,即可得到包裹pEGFP-C3的MPEG-PLGA/pEGFP-C3复合物。

1.2.2 复合物粒径检测 用Malvern粒度测定仪测其MPEG-PLGA/ pEGFP-C3复合物的粒径。

1.2.3 细胞转染试验 ①细胞准备：液氮保存的细胞由于很多机能处于休眠状态，为获取理想的细胞活性，液氮中冻存的NIH3T3细胞复苏后需传3代以便细胞恢复正常活力，观察细胞的形态与机能恢复正常后转入6孔细胞培养板继续培养，等细胞铺满培养皿底部达75%时将其分为2组，每组9孔细胞准备转染。②细胞转染：取去内毒素的MPEG-PLGA/pEGFP-C3复合物加入第1组培养孔中；将pEGFP-C3裸质粒加入第2组培养孔中以对照，将两组混匀后静置15 min，然后在37℃ 5%CO2培养箱中培养24 h后更换培养液继续培养。③观察与阳性细胞统计：培养48 h后在倒置荧光显微镜下观察转染效果，每孔在40倍视野下随即选取6个视野，记录每个视野中显示绿色荧光的阳性细胞的数量，取均数进行统计学分析。

2 结果

2.1 MPEG-PLGA/DNA纳米胶囊复合物的粒径测定结果如图1所示，纳米粒粒径呈单式正态分布，平均粒径为28.3 nm，多分散系数为0.21，表明纳米粒大小较均匀，分布范围窄。

3.2细胞培养结果荧光显微镜下观察可见，转染24 h细胞有绿色荧光表达，48 h达高峰，两组结果见图2。裸质粒组不但荧光表达弱且仅有少量阳性细胞，转染率不足3%，MPEG-PLGA/pEGFP-C3复合物组阳性细胞达15.3%，荧光表达强。结果证明MPEG-PLGA/pEGFP-C3复合物的转染效果远远大于裸质粒。

图1 MPEG-PLGA/DNA纳米胶囊复合物粒径

图2 两组转染效果对比图

3 讨论

MPEG-PLGA由乳酸和羟基乙酸两种单体聚合而成,具有良好的生物相容性,无毒、无刺激、无免疫原性和药物缓释等特性，特别是具有很好的中枢神经系统生物相容性，分子量0.5～20万[5]，常作为一些水溶性差、自身性质不稳定、体内代谢快、生物利用度低类化学药物的给药载体，在应用中大多采用溶剂挥发法或透析法等制备微粒胶囊，这些方法大都涉及到二氯甲烷、乙腈、丙酮等有机溶剂的使用，残留的有机溶剂不仅对人体具有很大危害，导致副作用的发生，而且容易破坏目的基因片段中DNA之间的链接，使其发生断裂，在基因治疗过程中不能正确表达治疗蛋白。为了解决这一问题，本试验利用共聚物比聚乳酸具有更大的亲水性，并且具有温敏水凝胶的特性(即其水溶液在4℃时完全溶于水，在37℃时变为水凝胶[6])提出了一种新型制备纳米胶囊的方法——直接溶解法。该方法将MPEG-PLGA溶解于4℃的双蒸水中，加入真核质粒混合后逐渐升温至37℃，利用温敏水凝胶的特性使其在形成凝胶颗粒时包裹游离在水溶液中的真核质粒，形成具有良好生物相容性的MPEG-PLGA/真核质粒复合物，该复合物穿越细胞膜后MPEG-PLGA凝胶颗粒在机体一些催化酶的作用下很快溶解释放出真核质粒，质粒在细胞内表达相应蛋白从而起到治疗疾病的目的，此方法在微粒胶囊制备时没有剧烈的震荡和有机溶剂的参与，可有效保护目的基因片段的完整性。本试验中利用细胞内绿色荧光蛋白的表达观察MPEG-PLGA/真核质粒复合物的转染效率。试验结果显示MPEG-PLGA/真核质粒复合物组转染效率(15.3%)明显高于作为对照的裸质粒组(3%)，证明利用MPEG-PLGA包裹真核质粒可有效提高其转染效率，另外根据MPEG-PLGA的特性，可通过改变聚合物单体比例和分子量，调控共聚物在体内的降解速度、DNA包封率以及基因体内释放速度。试验结果表明MPEG-PLGA可以作为一种新型跨膜载体在临床与研究中得以应用。

参考文献：

[1] Glorioso JC,Fink DJ.Herpes vector-mediated gene transfer in the treatment of chronic pain[J].Mol Ther,2009,17(1):13-18.

[2] 宗莉，陈伶俐，张淑芸,等.壳聚糖纳米粒作为基因载体的研究：制备，特征和对DNA的保护[J].中国药科大学学报,2005,36(6):526-530.

[3] Richardson scw，Kolbe ⅣJ，Duncan R,et al.Potential of low molecular mass chitosan as a DNA delivery system：biocompatibility, body distribution and ability to complex and protect DNA[J].Im J Pharm,1999,178(2)：231-243．

[4] 曾萍,彭明利,徐溢.PLGA微粒/纳米粒基因载体的研究进展[J].药学学报,2010,45(11):1346-1353.

[5] 方琴,王季石,许红玮,等.紫杉醇mPEG2PLGA纳米粒的制备及其抗肿瘤作用研究[J].中国药学杂志,2007,42(19):1483-1486.

[6] 王刚,潘丽,张永光.PLGA纳米/微球作为核酸载体的研究进展[J].微生物学通报, 2009,36(12):190-198.