促红细胞生成素对体外帕金森病模型细胞凋亡及Bax蛋白表达的影响

卢 欣

郑州大学基础医学院 郑州 450052

目前的药物治疗能够改善帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）患者的部分症状，但不能改变疾病最终结局，目前仍缺乏有效的治疗药物和预防措施。近年研究发现促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种细胞保护剂，其保护作用在多种中枢神经系统疾病模型中得到证实［1-2］。本试验通过观察EPO 对体外PD 模型细胞凋亡和Bax蛋白表达的影响，探讨促红细胞生成素对PD 细胞的保护作用，为临床治疗PD 提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 实验用SD 乳鼠（＜24h）由郑州大学实验动物中心购得，试剂6-OHDA、DMEM 高糖培养基和特级胎牛血清购自美国Sigma公司，兔抗鼠TH 试剂盒和Bax免疫组化试剂盒购自武汉Boster公司，TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒（比色法）购自北京中昊生物公司，EPO 购自沈阳三生制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：将12只乳鼠用75%酒精消毒，在超净台内断头取出中脑腹侧部，剔除干净脑膜和血管，用预冷的PBS洗涤3遍，加入0.25%胰酶12mL 在37℃水浴消化20min，加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液终止消化1min，2 000目滤网过滤。按2×105／mL 和1×105／mL加入6孔板和96孔板中，37℃、5%CO2孵箱中培养，隔日换液。培养至第7天加入EPO（10U），12h后加入6-OHDA（100μmol／L），分为对照组，6-OHDA 组和EPO＋6-OHDA 组。

1.2.2 TH 免疫组化鉴定多巴胺能神经元：处理后的细胞按TH 试剂盒说明操作进行，细胞膜或胞浆内出现棕黄色产物的细胞为TH 阳性细胞即多巴胺能神经元。

1.2.3 TUNEL 法 细 胞 原 位 凋 亡 检 测：凋 亡 细 胞 采 用TUNEL法检测，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.4 Bax免疫组化染色：用SABC 法，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.5 结果观察：在显微镜下观察TH 阳性细胞、TUNEL阳性细胞和Bax免疫阳性细胞的表达情况，用媒体真彩色病理图文分析系统对图像进行分析。

1.3 统计学方法 数据用SPSS 13.0进行统计学处理，采用t检验和方差分析，结果均以（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TH 阳性细胞 TH 阳性细胞为棕黄色的多巴胺能神经元细胞。6-OHDA 组TH 阳性细胞明显减少，神经元突起变短消失；EPO＋6-OHDA 组神经突起较长且较多，相互交织在一起。

2.2 TUNEL法凋亡细胞检测 TUNEL 染色阳性的凋亡神经元呈三角形或扇形，固缩深染，体积缩小，胞核呈棕黄色，非凋亡细胞则为蓝色。6-OHDA 组存在明显的神经元细胞凋亡（P＜0.05），EPO＋6-OHDA 组神经元凋亡细胞明显减少（P＜0.05）。见表1。

2.3 Bax蛋白表达 Bax蛋白表达部位在神经元细胞的胞质，Bax阳性神经元形状不规则，胞内沉积有棕黄色物质。6-0HDA 组Bax蛋白表达较高（P＜0.05），EPO＋6-OHDA 组Bax蛋白表达减少（P＜0.05）。数据见表1。

表1 促红细胞生成素对多巴胺能神经元的保护作用（±s，n＝6）

表1 促红细胞生成素对多巴胺能神经元的保护作用（±s，n＝6）

与对照组比，＊P＜0.05；与6-OHDA 组比，△P＜0.05

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3 讨论

帕金森病（Parkinson＇s disease，PD）是一种以静止性震颤、肌肉僵直、运动弛缓和姿势步态异常等症状为主要临床表现的中枢神经退行性疾病。其主要病理特征为中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡。到目前为止，PD 的发病机制仍不完全清楚。研究表明6-OHDA 可在体外诱导多巴胺能神经元细胞的凋亡［3-4］。该实验用6-OHDA 干预制作体外帕金森病模型，TH 免疫组化方法鉴定多巴胺能神经元，TUNEL法检测PD 模型细胞凋亡和测定Bax表达。

促红细胞生成素（EPO）是一种有效的神经细胞保护剂，在多种神经系统的疾病模型中已经得到证实［1］。EPO 受体在一定条件下能够在多巴胺能神经细胞表面表达，说明EPO对其可能有保护作用［5］。在MPTP 诱导的PD 模型中，EPO可以使神经元凋亡率下降［6］。Tatton等和Adams等的研究证实PD 患者黑质神经元Bax表达增强，细胞凋亡增加［7-8］。Kumral等的研究证实EPO 可以降低促凋亡蛋白Bax的表达［9］保护神经元细胞。其可能的机制是减少线粒体内活性氧的产生，导致细胞色素C 产生减少，使Caspase活性减弱，从而抑制了细胞凋亡［10-11］。Yan等［12］实验也表明EPO 对PC12细胞的PD 模型有明显的保护作用，Bax蛋白表达减少凋亡细胞减少。本实验在制作PD 模型前预先加入EPO 保护，测定凋亡细胞和Bax蛋白，发现与对照组比较，6-OHDA组细胞凋亡有显著性差别（P＜0.05），同时Bax蛋白表达明显增高（P＜0.05）。而预先加入EPO 后情况明显不同，EPO＋6-OHDA 组与6-OHDA 组比较，凋亡细胞数目和Bax蛋白表达均明显减少（P＜0.05），说明EPO 对PD 的神经元细胞有保护作用，使Bax蛋白表达下降细胞凋亡减少。

EPO 能一定程度上抑制细胞凋亡减少Bax蛋白表达，从而保护多巴胺能神经元细胞，因此EPO 可以作为神经保护剂，为临床治疗和预防PD 提供新的理论依据。

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