不同剂量α-硫辛酸对卡那霉素所致豚鼠耳聋后听觉诱发电位的影响

米彦芳 董明敏

1）郑州大学第二附属医院耳鼻喉科 郑州 450014 2）郑州大学第一附属医院耳科 郑州 450052

α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，LA）是一种抗氧化剂，可通过清除自由基、螯合金属离子、再生其他抗氧化剂等途径发挥抗氧化作用。其优势在于可以在水、脂两相状态发挥其抗氧化作用；以及可以通过血-迷路屏障及血-脑屏障［1］。有研究表明，它可以阻止卡那霉素的激活；抑制活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的形成；清除多余的ROS；增加体内其他抗氧化物质（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛）的含量及其活性等方式，发挥其保护耳蜗内、外毛细胞等组织细胞的作用。

1 实验材料与方法

1.1 动物及分组 70只白色、红目豚鼠（选用耳廓反射灵敏；健康；无中耳疾病），雌雄不分，体质量120～150g，由河南省实验动物中心提供。听性脑干反应（ABR）检查阈值正常。在实验期间，自由饮食。按照随机抽样的原则，将试验动物分成7组（每组10只，20耳）：Ⅰ组：正常对照组：不施加任何处理因素；Ⅱ组：KM 组：KM 400 mg／（kg·d）。Ⅲ组：LA 组：LA 50 mg／（kg·d）。Ⅳ组：治 疗 组1（25 mgLA）：KM 400mg／（kg·d）＋LA 25 mg／（kg·d）。Ⅴ组：治疗组2（37.5 mgLA）：KM 400 mg／（kg·d）＋LA 37.5mg／（kg·d）。Ⅵ组：治疗组3（50 mgLA）：KM 400 mg／（kg·d）＋LA 50 mg／（kg·d）。Ⅶ组：治疗组4（75 mgLA）：KM 400mg／（kg·d）＋LA 75mg／（kg·d）。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 主要仪器：Cadwell Quantum 84型诱发电位系统（美国产），及其配套的Microline-184型打印机。

1.2.2 主要试剂：KM：购自安徽省皖北药业股份有限公司；LA：上海浦东制药厂。

1.3 实验方法

1.3.1 用药方法：Ⅱ组、Ⅳ～Ⅶ组豚鼠，KM 肌内注射400 mg／（kg·d），连用7d。Ⅲ～Ⅶ组豚鼠的LA 腹腔注射。同时用KM 及LA 时，两药相隔时间12h。

1.3.2 观察指标及方法：观察豚鼠的一般行为，记录；停药后测ABR。

1.3.3 ABR 测试：麻醉：选用10%水合氯醛（150 mg／kg），腹腔内注射。麻醉达成后，置实验豚鼠于隔离的电屏蔽室内。隔离室内，本底噪声选用30dB HL。测试期内，豚鼠肛温保持在38℃左右。

1.4 统计学分析 本实验的数据采用SPSS 13.0 统计软件，进行统计学分析，采用t检验、单因素方差分析，以α＝0.05作为检验的标准。

2 结果

2.1 日常状态 Ⅱ组（KM）和Ⅳ组（25mg LA）的豚鼠在给药后2d，即可出现以下反应：活动量下降；饮食量减少。继续给KM 及LA，上述反应日渐明显，并出现耳廓下垂、毛蓬松并失去光泽等现象。其余各组豚鼠无明显异常的表现。

2.2 ABR 结果 见表1、2。各波的潜伏期、Ⅰ～Ⅲ波间期及阈值：Ⅰ组（正常对照组）、Ⅴ组（37.5 mg／（kg·d）LA 治疗组）～Ⅶ（75mg／（kg·d）LA）组之间的各波的潜伏期、Ⅰ～Ⅲ波间期及阈值的差异，无统计学意义。Ⅲ组（LA 组）和Ⅳ组（25mg／（kg·d）LA）的各波的潜伏期、和Ⅰ～Ⅲ波间期稍延长，阈值稍高。虽然Ⅲ组和Ⅳ组之间的差异没有统计学意义。但是，与其他组豚鼠ABR 的差异显示出统计学意义。Ⅱ组（KM 组）豚鼠的ABR 各波潜伏期、及Ⅰ～Ⅲ波间期最长，阈值也最高，与其他各组豚鼠ABR 的差异有统计学意义。

表1 ABR 结果 （ms）

表2 ABR 阈值结果 （dB）

3 讨论

3.1 卡那霉素耳毒性机制 实验可见，KM 组的豚鼠ABR各波的潜伏期以及Ⅰ～Ⅲ波的间期都明显延长，并伴随阈值上升。由此可见：400mg／（kg·d）卡那霉素，连用一周，即可损伤到豚鼠耳蜗的组织细胞，发挥其耳毒性作用。

虽然，学术上关于氨基糖甙抗生素的耳毒性机制有许多观点；但是，伴随着可直接检测到使用氨基糖甙类抗生素以后，耳蜗组织内可产生出大量的ROS，氨基糖甙类抗生素可以在耳蜗的组织细胞内诱发ROS的合成已成为定论。随着大量的实验证据表明：在卡那霉素的耳毒性机制中，ROS增多发挥着重要作用。1999年Sha［2］等证实卡那霉素、庆大霉素、链霉素、新霉素等氨基糖甙类抗生素均可刺激耳蜗组织细胞产生ROS，同时提出可能的机制：（1）铁与氨基糖甙类抗生素形成非活性的复合体：Fe3＋-AmAn；（2）Fe3＋-AmAn还原成Fe2＋-AmAn，后者具有氧化活性；（3）催化O2与一电子形成.O2-；（4）经过链式反应形成：如H2O2等自由基。在耳蜗组织细胞中，每一步还原过程都可以产生“副产品”--ROS。该研究还进一步地证实了ROS与氨基糖甙类抗生素的耳毒性之间的关系，并提出ROS清除剂可拮抗氨基糖甙类抗生素的耳毒性。

3.2 LA 的抗氧化性 以及抗氨基糖甙类抗生素耳毒性的机制α-硫辛酸，美国生物化学医学会称其为lipoic acid（LA）［3］，因此，本文以LA 称之。作为高效的、能量型氧自由基清除剂，LA 的分子量很小（＜150），还是存在于人体内的、天然型代谢物质。因此，外源性的LA 很容易被机体的组织细胞吸收和利用。另外，LA 在机体组织内容易转化，可被还原为二氢硫辛酸（dihydrolipoic acid，DHLA）。所以，LA 在机体组织内是以LA 和DHLA 两种形式存在的，二者在体内互相协调、互相补充，有效地清除大部分的氧自由基。LA 可以螯合金属离子，抑制ROS的产生，及防止脂质过氧化的损伤。LA 和DHLA 二者都为双歧性因子，其溶解性无论在脂相还是水相中均表现良好，其抗氧化作用可以充分发挥。LA 可通过血-脑屏障和血-迷路屏障，可以在内耳迷路中发挥其抗氧化作用。LA 还可再生其他的抗氧化剂：如激活VitC、VitE、GSH 等，进一步对机体的抗氧化防御系统进行修复；对有关组织细胞正常生长和代谢起影响作用的调节蛋白进行保护；对HIV 的复制过程进行抑制；抑制性影响转录因子NF-κB的激活过程。故而作为“通用型抗氧化剂”得到共识［4-5］。大量资料对于LA 的抗氧化效果进行了肯定。

本研究显示：Ⅴ组～Ⅶ组的豚鼠，一般情况和ABR 结果等观察项目，与Ⅰ组相比较，差异无统计学意义。与Ⅱ组相比，Ⅳ组中豚鼠的各项观察指标提示明显改善。由此分析：LA 对卡那霉素致耳毒性作用起拮抗效应，可以对豚鼠的耳蜗组织细胞起保护作用。与Conlon［6］等采用LA 对氨基糖甙类抗生素耳毒性进行拮抗研究的观察结果。

氨基糖甙类抗生素在进入机体后，特别是在内淋巴内由Fe进行激活，可增加耳蜗组织细胞内的ROS，从而对耳蜗的抗氧化防御系统进行破坏，造成LPO 损害。由此提示LA 对卡那霉素致耳毒性的拮抗机理有可能是：（1）LA 螯和金属Fe，防止激活卡那霉素，抑制生成ROS。（2）增加抗氧化剂（包括SOD、GSH、维生素等）的活性和含量，保护耳蜗组织的抗氧化防御系统，同时，清除多余的ROS，抑制LPO、对耳蜗组织起保护作用。（3）对于调节蛋白（起维持组织细胞生长及代谢作用）起保护作用。最值得关注的是：LA 可进入迷路组织，发挥抗氧化作用。因此，LA 可以用于防治氨基糖甙类抗生素的耳毒性。本实验，在进一步证实ROS在卡那霉素耳毒性机制中，发挥重要作用的同时高度评价了LA 抗氨基糖甙类抗生素耳毒性的临床治疗价值。

在本研究中对Ⅲ组豚鼠的各项指标观察结果显示：即使单纯应用大剂量LA，也可以产生耳毒性效应。此项结果与Conlon［6］的观察并不一致。检索既往的文献报告，相关的实验及临床研究中未见类似报道。亦有其他研究报道，在生理条件下，外源性LA 可以对机体内的氧化反应起抑制作用，从而起到超抗氧化效应［7］。可是，对正常机体组织而言，超抗氧化作用究竟是利是弊，与相关的生物体系有关，对此仍需进一步审重评估。在既往的实验中，该药一贯表现出较好的耐受性，在针对人体的临床研究中，亦未见显著不良反应和毒性表现。故而，LA 的耳毒性可能与超抗氧化作用有关，也可能是制剂纯度不够，甚或有其他原因存在，目前尚无清晰认识。本研究尚不可以由此推论，LA 的大剂量应用会导致豚鼠的听力出现下降，仍需要深入的实验研究。

［1］Packer L.Alpha-lipoic acid：A metabolic antioxidant which regulates NF-kappa B signal transduction and protects against oxidative injury［J］.Drug Metab Rev，1998，30：245-275.

［2］Kopke R，Allen KA，Henderson D，et al.A radical demise：toxins and trauma share common pathways in hair cell death［J］.Ann NY Acad Sci，1999，884：171-191.

［3］Biewenga G，Haenen GR，Bast A.The role of lipoic acid in the treatment of diabetic poly-neurophathy［J］.Drug Metab Rev，1997，29（4）：1 025-1 054.

［4］Packer L.Alpha-lipoic acid：A metabolic antioxidant which regulates NF-kappa B signal transduction and protects against oxidative injury［J］.Drug Metab Rev，1998，30：245-275.

［5］Roy S，Packer L.Redox regulation of cell functions by alpha-lipoicoate：Biochemical and molocular aspects［J］.Biofactor，1998，8：17-21.

［6］Conlon BJ，Aran JM，Erre JP，et al.Attenuation of aminoglycoside-induced cochlear damage with the metabolic antioxidant α-lipoic acid［J］.Hear Res，1999，128：40-44.

［7］Biewenga GP，Haenen GR，Bast A.The pharmacology of the antiocidant lipoic acid［J］.Gen Pharmac，1997，29：315-331.