电针对先天性脑损伤仔鼠脑白质神经髓鞘修复的影响

翟洪建 王风波 虞乐华

1.成都医学院第一附属医院康复医学科，四川成都 610500；2.重庆医科大学第二附属医院康复医学科，重庆 400010

宫内感染（intrauterine infection）作为新生儿脑白质损伤（NWMD）的重要致病因素，已得到广泛证实。少突胶质细胞（OL）及脑白质神经髓鞘的损伤均是NWMD的主要病理特点，OL的成熟前体是少突胶质前体细胞（OPCs），对感染和缺血极为敏感。本研究建立先天性脑损伤仔鼠模型，经电针干预治疗，电子显微镜下观察脑白质神经髓鞘的超微结构，测量并计算出髓鞘厚度平均值，进而从髓鞘厚度的角度探讨电针治疗对先天性脑损伤及脑白质神经髓鞘修复的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级成熟Wistar雌性大鼠38只，雄性大鼠19只，体重≥210 g，全部由四川动物实验中心提供；脂多糖（LPS血清型055：B5，美 国SIGMA公 司）；120KV透 射 电 子 显 微 镜（JEM-1200EX)（日本电子株式会社）。

1.2 方法

参照王风波等[1]方法使用的制备宫内感染致先天性脑损伤仔鼠模型。孕鼠随机分为生理盐水对照组（n=4）和LPS组（n=29），两组均去除孕22 d前分娩的早产鼠。仔鼠出生后，对胎盘做HE染色病理学检测，大量的中性粒细胞浸润为宫内感染的判断标准。随机选取生理盐水对照组仔鼠22只（n=22），LPS组仔鼠40只（n=40）；LPS组仔鼠随机分为非干预组22只（n=22）、电针组18只（n=18）；于24 h随机处死对照组和非干预组仔鼠各4只，行脑组织病理学检测。电针组仔鼠于第7天开始进行电针干预，对照组、非干预组仔鼠均常规饲养。分别于第14天、第28天取各组仔鼠脑白质测量神经髓鞘厚度。

1.3 电针干预

选取仔鼠百会、曲池及足三里诸穴，具体操作参照《实验针灸学》[2]及王风波等[1]方法：仔鼠顶骨正中定百会，桡骨近端的关节外侧凹陷处取曲池，膝关节后外侧腓骨小头下约5 mm处定足三里，采用直径0.2 mm、长20 mm的华佗牌针灸针，各穴均连接电针仪，调设连续波，5～10 Hz频率，3～5 V强度，以头部轻微抖动为宜，持续刺激10 min。每日1次，干预至第28天。

1.4 电镜标本及图片制作

参照王风波等[3]方法制备常规脑白质电镜标本，用球切法（isector）包埋抽取出的脑白质组织块，确保各方向分布的神经纤维均有相同抽样概率，再以常规电镜包埋法包埋组织块，每个包埋好的脑白质组织块随机切取一张60 nm的超薄切片，透射电子显微镜下观察髓鞘情况，每张切片随机选取5个视野，放大20 000倍拍照。

1.5 脑神经髓鞘厚度测量方法

参照Larsen[4]方法，在放大20 000倍的照片上随机叠加等距测试线，计数每个待测髓鞘断面的内外边界与测试线的交叉点数，将髓鞘内边界与测试线的交点按顺序编号，总数为I，随机选取前I/4中的一个编号作为首个髓鞘厚度的测试点，其所在位置+I/4为第二个测试点，第三个测试点为第二点位置+I/4，第四个测试点为第三点位置+I/4，于这4个测试点处分别测量髓鞘内外边界的最短距离，取其平均值为髓鞘厚度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验,多组间均数比较采用q检验，非正态分布和方差不齐时，用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎盘病理检查结果及新生仔鼠脑组织病理改变

LPS组孕鼠胎盘内见大量中性粒细胞浸润，对照组母鼠胎盘无炎症反应。LPS组仔鼠脑白质结构疏松，其内大量胶质细胞聚集，并有血管扩张，脑室内出血等病理改变；对照组仔鼠脑白质结构完整，无明显胶质细胞聚集、血管扩张及出血等，且核仁清楚，布局有序。

2.2三组仔鼠脑白质神经髓鞘厚度测量结果

非干预组、电针组仔鼠脑白质神经髓鞘厚度平均值均明显低于对照组，组间差异有高度统计学意义（P﹤0.01）；电针组仔鼠髓鞘厚度平均值高于非干预组（P﹤0.01）；各组第14天与第28天组内比较，差异均有高度统计学意义（P﹤0.01）。见表1、图1～3。

表1 三组仔鼠脑神经髓鞘平均厚度检测情况比较(±s)

表1 三组仔鼠脑神经髓鞘平均厚度检测情况比较(±s)

注：与对照组比较，*P﹤0.01；与非干预组比较，△P﹤0.01；与同组14 d比较，▲P﹤0.01

组别14 d只数 髓鞘平均厚度（nm）28 d只数 髓鞘平均厚度（nm）对照组非干预组电针组999 109.7667±9.7985 65.4457±6.9376*88.5768±2.6786*△999 126.5667±4.5768▲88.4465±5.3365*▲110.5546±4.6673*△▲

图1 对照组14日龄仔鼠脑白质神经髓鞘（电镜×20 000）

图2 非干预组14日龄仔鼠脑白质神经髓鞘（电镜×20 000）

图3 电针组14日龄仔鼠脑白质神经髓鞘（电镜×20 000）

3 讨论

神经髓鞘由OL突起的胞膜包卷轴突而成，脱髓鞘损害与OL受损息息相关。中枢神经系统（CNS）髓鞘缺失的主要因素包括髓鞘合成障碍及过多破坏两方面，髓鞘合成障碍多见于先天性损伤，如脑室周围白质软化（PVL），髓鞘的过多破坏则见于继发于全身性疾病和炎性脱髓鞘病(IIDDs)[5]。PVL通常出现于妊娠第28～34周，是NWMD的主要表现形式。宫内感染是WMD的重要病因之一，不但可以直接侵犯胎儿中枢神经系统，而且可以通过引起炎症反应和干扰胎盘血流循环致胎儿脑的血供减少，引起胎儿中枢神经系统炎性和缺血性损伤[6]。王风波等[3]研究显示，宫内感染可致脑损伤仔鼠脑白质神经脱髓鞘损害。OL是神经胶质细胞的主要类型之一，主要参与髓鞘的形成，其成熟前期的OPCs对感染和缺血极为敏感，NWMD的主要病理表现即包括髓鞘与轴突的损害。髓鞘的修复与再生是人体复杂的自我调节功能之一，神经元及神经胶质细胞均参与到其各个阶段的精细调控，大脑白质内大量的并行的髓鞘化轴突毗邻OL，接受OL提供的髓鞘形成所需的必要物质，若OL受到损伤，与其毗邻的轴突便将面临髓鞘缺损的状况。OL还可合成新的髓鞘来包绕暴露的轴突，并且通过释放各种神经营养因子促使受损轴突的修复[7]；同时，遭受失髓鞘的神经元自身的功能恢复，也对髓鞘的修复和再生有着重要的作用。另外，神经胶质细胞的另外两种类型：小胶质细胞和星形胶质细胞，在WMD发生后很快反应，通过次级激活，产生数量庞大的细胞因子，进而激活前体细胞，对于髓鞘再生亦是不可或缺的因素[8]。而早期的积极干预对WMD的治疗作用毋庸置疑，王风波等[3]发现，早期丰富康复训练不但能在形态上改善脑损伤仔鼠脑白质神经髓鞘的状况，并且能显著地增强仔鼠脑组织脑源性神经营养因子（BDNF）的阳性表达，对受损神经髓鞘的修复和再生具有积极地促进作用。

针刺治疗脑损伤历史悠久，疗效确切，对于穴位的解释，传统医学认为，百会属督脉穴，与脑密切相关，曲池、足三里属阳明经合穴，功效醒脑开窍，针刺督脉百会穴及阳明经合穴治疗脑损伤，可振奋周身之阳气，疏经通络，促进气血运行，促进肢体功能康复。电针疗效明显优于单纯针刺或电刺激，已得到大量研究证实。王风波等[3]取“百会、足三里”诸穴，对先天性脑损伤仔鼠进行电针干预，发现脑损伤仔鼠脑组织BDNF阳性表达明显增强，对于脑损伤的功能重塑及恢复具有积极意义；芮君等[9]电针刺激脑缺血大鼠“百会、风府”穴，脑组织BrdU／NSE和Brdu／GFAP阳性细胞的数量均明显增多，进而促进中枢神经干细胞增殖分化。

基于以上理论及研究成果，本研究采用宫内感染致先天性脑损伤仔鼠模型，参考王风波等[3]采用的体视学技术，测量仔鼠脑白质神经髓鞘厚度并计算平均值，从脑白质神经髓鞘厚度的角度探讨电针对先天性脑损伤的治疗作用。通过实验结果，本研究说明，积极而早期的电针干预可提高脑白质神经髓鞘厚度平均值，有利于脑白质神经髓鞘的修复与再生，为进一步研究电针在小儿脑损伤治疗的临床运用方面提供一定的客观依据和积极的指导意义。

[1]王风波，李晓捷，唐明薇.电针对先天性脑损伤仔鼠脑组织脑源性神经生长因子表达的影响[J].中国中西医结合儿科学杂志，2011，3（3）：213-216.

[2]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：22-27.

[3]王风波，李晓捷，唐明薇.丰富康复训练对先天性脑损伤仔鼠脑神经髓鞘发育和修复的影响[J].中国伤残医学杂志，2011，19（9）：6-9.

[4]Larsen JO.Stereology of nerve cross sections[J].J Neurosci Methods，1998，85（1）：107-118.

[5]戚晓昆.中枢神经系统特发性炎性脱髓鞘病临床进展[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2008，15（2）：77-79.

[6]程璐，陈晓光.TORCH病原及其检测技术研究进展[J].中国病原生物学杂志，2008，3（3）：223-226.

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[8]方依卡.中枢神经系统髓鞘再生的生物学机制[J].临床医学工程，2010，17（3）：154-155.

[9]芮君，裴海涛.电针刺激对脑缺血大鼠神经干细胞分化的影响[J].上海针灸杂志，2011，47（4）：326-327.