猪流行性腹泻病毒SZ株的分离与鉴定

郝伟伟 邱文英 徐 静 方鹏飞 向丕元 张丽燕 胥燕芳

（四川省华派生物制药有限公司 四川简阳 621400）

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diahorrea Virus，PEDV）是引起猪呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状特征的猪肠道传染病病原，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各年龄段均可发病，但哺乳仔猪发病和死亡最为严重［1-3］。该病多发生在冬春寒冷季节，我国以12月至次年2月为高发季节。猪流行性腹泻于1971年首次在英国报道［4］，比利时、英国、德国、法国、荷兰、瑞士、保加利亚和中国台湾等国家和地区都有发生［5］。中国从1976年开始有流行性腹泻的报道，20世纪80年代后该病在中国流行面逐渐扩大［6］。流行性腹泻病毒常与猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒等其他肠道病原混合感染，给养猪业造成严重经济损失。

1 材料与方法

1.1 材料1.1.1 病料 来自资阳某猪场发生腹泻、呕吐、死亡仔猪的粪便。

1.1.2 生化试剂 TRIzol Reagent为Invitrogen公司产品；RNA PCR Kit、Mix、D2000 DNA Marker、胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；琼脂糖购自GIBCO公司。

1.1.3 细胞及培养试剂 绿猴肾细胞（Vero），购自中国兽药检查所；DMEM营养液、胰蛋白酶购自GIBCO公司；FITC标记的羊抗鼠IgG抗血清，购自康为世纪。

1.1.4 病毒鉴定引物 根据GeneBank报道的PEDV S基因cDNA序列（登陆号DQ072726），设计1 对引物，P1：5′-TCGTTTTGGGTGGTTACCAC-3′；P2：5′-AGTGGCAAATACATTGGC AGCG-3′。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 取检粪样用PBS以1：10的重量体积比进行稀释后，研碎混合均匀，反复冻融3次。该混合物于4℃ 4000 r/min离心15 min，取上清液于0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液分装，-70℃保存。

1.2.2 RT-PCR检测 采用Trizol法提取待检样品中的病毒RNA，使用引物P2及逆转录试剂盒进行cDNA扩增，扩增条件：42℃反应50 min，72℃灭活10 min。以cDNA为模板，引物P1、P2进行PCR扩增，循环参数：94℃预变性3 min，94℃变性1 min，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物进行电泳检测。

1.2.3 病毒分离 按常规方法制备Vero细胞，培养24 h至单层，按5%接种检测阳性的病毒液，并添加胰酶至终浓度50 μg/mL，37℃吸附1 h，其间轻摇2次。待吸附结束后，加入含有终浓度50 μg/mL胰酶和含2%血清DMEM溶液作为维持液，37℃培养，72 h作为一个传代周期。传代前，将上一次的细胞培养物反复冻融3次，按上述方法进行盲传。

1.2.4 病毒鉴定

1.2.4.1 病毒的免疫荧光检测 将分离毒株的病毒液1.0 mL接种已长成单层的Vero细胞上，48 h后（同时设立不接毒的Vero细胞为阴性对照），弃去培养液，用PBS洗涤2次。加入1000 μL丙酮置于4℃固定15 min。弃去固定液，敞开培养瓶自然干燥。将细胞单层用PBS冲洗3次，然后将细胞单层用5%脱脂乳封闭30 min，之后倒去脱脂乳，加入稀释的兔抗PEDV阳性血清（1：100），滴加细胞培养瓶内，放入37℃温箱内作用1 h；用PBS洗涤3次，再加入稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗血清（1：200），滴加细胞培养瓶内，放入37℃温箱内作用1 h；然后用PBS冲洗3次，避光干燥，放到荧光显微镜上观察各种细胞中的荧光强弱。

1.2.4.2 S基因部分序列测定 采用Trizol法提取待细胞培养物的病毒RNA，以P1、P2为引物进行RT-PCR方法扩增M基因片段，进行电泳，切下目的片段进行胶回收。回收到的DNA片段送至英潍捷基生物公司进行基因测序。将测序结果与GeneBank报道的PEDV S基因cDNA序列进行比对。

1.2.5 动物回归试验 将培养的流行性腹泻病毒液稀释至病毒含量为105.0TCID50/mL，口服接种猪流行性腹泻病毒血清学阴性的3～5日龄仔猪，1.0 mL/头，设DMEM细胞培养基的仔猪3头作为对照，试验组和对照组隔离饲养，接种后观察7 d。

2 结果

2.1 RT-PCR检测结果 以P1、P2为引物，用RTPCR方法检测待检样品，电泳结果见图1。1号样品有特异性条带，约600 bp，呈阳性，2、3号样品及空白对照无条带。

图1 RT-PCR检测样品中的PEDV

2.2 病毒分离结果 病毒盲传至第3代时，于细胞接种第3 d出现细胞病变（CPE），传至第6代时于36 h后出现CPE，CPE表现为细胞折光度降低、圆缩、颗粒变性、融合，进而脱落。继续传10代，出现CPE时间稳定，第10代收获培养物，病毒含量达106.5TCID50/mL。

2.3 病毒鉴定

2.3.1 病毒的间接免疫荧光检测结果 使用兔抗PEDV阳性血清，PEDV接种Vero细胞40 h后，在胞中检测到病毒的抗原，可见强烈的荧光。而在PEDV未感染的Vero细胞中，并未见任何绿色荧光，说明PEDV在Vero细胞中复制增殖。

2.3.2 S基因序列扩增结果 以P1、P2为引物扩增细胞培养物S基因，电泳结果见图2。使用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收目的片段，电泳检测结果见图3，条带单一明亮，送样测序。

图2 部分S基因的扩增

图3 胶回收结果

测序结果为所扩增DNA长度为592 bp（见图4）；编码 197个氨基酸（见图5）。

将所扩增部分S基因序列与Genebank上登录的其他流行性腹泻病毒株的S基因相比较，使用MEGA4.0建立系统进化树，见图6。结果表明PCR扩增的部分S基因与CH/XJUrumqi/2011的S1基因同源性最高，为98.3%，氨基酸同源性97.97%；与AF500215 S1（Korean）基因同源性和氨基酸同源性分别为93.25%和89.34%。与日本株KH及中国LZC株同源性要低一些。

2.4 动物回归试验 猪流行性腹泻病毒接种3～5日龄仔猪24 h后，仔猪陆续出现典型的呕吐、腹泻症状，3 d后出现死亡。剖检死猪发现，小肠扩张，内充满黄色液体，肠系膜充血，小肠绒毛缩短。采集发病仔猪的粪便进行RT-PCR检测，证明含有PEDV。对照组仔猪未出现感染症状。

3 结论与讨论

图4 扩增的DNA序列

图5 编码蛋白质的序列

图6 PEDV分离株S基因进化树分析

试验首先使用RT-PCR方法确定疑似发生猪流行性腹泻猪场仔猪的粪便样品中含有猪流行性腹泻病毒，再使用Vero细胞进行盲传。同时以RTPCR法扩增S基因的部分片段并测序，进行序列分析并结合免疫荧光检测及回归试验，证明分离得到一株猪流行性腹泻强毒株，命名为SZ株。

病毒分离的主要目的是通过对病毒的检测和纯化，获得纯化的病毒粒子，并将其进行传代培养。自20世纪70年代初发现以来，曾用各种方法试图把病毒适应于细胞培养，但是一直没有获得成功，成为病毒学上的一道难题。直到1988年瑞典Hoffman等首次在Vero传代细胞的培养液中加入胰酶，病毒培养获得成功，连续传5代出现细胞病变［7］。本次研究中也在培养液中加入50 μg/mL胰酶，以保证病毒生长繁殖。

传统方法鉴别诊断PEDV主要从病毒的抗原检测、病毒的电镜检测、病毒的分离与鉴定、血清学诊断等方面进行，这些方法都需要在检测前对病料进行一系列大量而烦琐的前期处理，耗时长。RT-PCR技术相对于传统方法而言，简便、快速且特异性高，能够用于疾病的早期检验［8-9］。

从2010年春季至今，我国的很多省份，以及泰国、菲律宾、韩国等亚洲国家的规模化猪场暴发严重的猪流行性腹泻疫情，病毒变异是猪流行性腹泻暴发的主要原因。2010年后我国国内的田间野毒株与经典毒株的遗传距离很大，导致传统的疫苗无法对猪群产生完全的免疫保护。有研究表明PEDV的变异主要集中在S基因上［10］，S基因编码S蛋白，在免疫反应中有识别靶细胞，使病毒和细胞膜融合的作用［11］。研究PEDV的S基因及S蛋白，比较不同病毒株的亲缘关系，对疫苗的研制及使用具有重要的意义。

［1］ 毛雅元，张桂红，葛俊伟，等.猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03 分离及培养特性［J］. 病毒学报，2010，26（6）：483-489.

［2］ 钱永清，闻人楚，唐永兰，等.猪流行性腹泻病毒的分离培养鉴定［J］.上海农业学报，1999，15（2）：41-44.

［3］ 倪艳秀，林继煌，何孔旺，等.猪流行性腹泻研究概况［J］.畜牧与兽医，2001，33（1）：38-39.

［4］ Pensaert M B，Debouck P.A New Coronavirus-like Particle Associated with Diarrhea in Swine ［J］.Arch Virol，1978，58（3）：243-247.

［5］ 张桂红.猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离鉴定［D］.哈尔滨：东北农业大学，2008.

［6］ 王龙涛，葛晨霞，王翠瑜，等.猪传染性胃肠炎病毒吉林株的分离鉴定及S基因的克隆与序列分析［J］.中国兽医学报，2010，30（10）：1277-1281.

［7］ Hofmann M，Wyler R.Propagation of the virus of Procine Epidemic Diarrhea in cell culture ［J］.J Clin Microbiol，1988，11：2235-2239.

［8］ Kinm O，Choi C，Kim B，et al.Detection and differentiation of porcine diarrhoea virus and transmissible gatroenteritis virus in clinical samples by mutiplex RT-PCR［J］.Vet Rec，2000，146（22）：637-640.

［9］ 田小艳，孙华，邓雨修，等.3种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR 检测［J］.动物医学展，2009，30（9）：54-57.

［10］ 刘孝珍，陈建飞，时洪艳，等.2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析［J］.中国预防兽医学报，2012，34（3）：180-183.

［11］ 刘邓，冉多良，袁秀芳，等.猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株S基因的克隆、原核表达和免疫原性分析［J］.黑龙江畜牧兽医，2010（2）：19-23.