杜洛克猪肠毒素大肠杆菌F4ac MUC13基因型与生长性能的关联性分析

阮国荣 肖石军 刘亚轩 陈福珍 林国忠 孙耀华

（1.福建农业职业技术学院 福州 350119；2.江西农业大学省部共建生物技术国家重点试验室培育基地南昌 330045；3.福建光华百斯特生态农牧有限公司 福建三明 365100；4.厦门国寿种猪开发有限公司 福建厦门 361000）

断乳前仔猪腹泻是养猪生产中的常见疾病，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。据保守估计，我国每年至少有1000万头断乳前仔猪腹泻致死病例。而产肠毒素大肠杆菌F4（ETEC F4）是引发新生和断乳前仔猪腹泻的最主要致病菌，ETEC F4的致病性取决于其是否能与猪小肠上皮细胞表面刷状缘的受体特异性结合，无受体猪表现为抵抗型，有受体猪则表现为易感型。ETEC F4有3种血清型：F4ab，F4ac和F4ad，而F4ac在西方猪群中是最主要的致病菌［1-2］。因而，抗腹泻育种的关键是检测ETEC F4ac受体基因。F4ac受体基因的定位和鉴别得到了国内外多个研究小组的重视，江西农业大学动物生物技术国家重点试验室培育基地自2002年以来，通过全基因组连锁定位分析、目的区域的断点重组分析和远缘群体的高通量SNPs标记关联性分析等遗传研究手段，确定了MUC13为决定断乳前仔猪腹泻易感性的ETEC F4ac受体基因［3］。

然而，随着断乳仔猪抗腹泻分子研究的深入及抗腹泻分子育种技术的推广，仔猪抗腹泻基因纯合的同时，其生长性能是否受到影响，也即MUC13抗性纯合基因型与生长性能是否具有负相关性，已是广大育种场家较为关注的问题。为此，本小组于2010-2012年在福建光华百斯特生态农牧有限公司和厦门国寿种猪开发有限公司两家国家级核心育种场进行了杜洛克MUC13基因检测和生长性能测定对比试验，以期探寻杜洛克猪ETEC F4ac MUC13基因型与生长性能的关联性。

1 材料与方法

1.1 试验动物 试验动物来自福建光华百斯特生态农牧发展有限公司、厦门国寿种猪开发有限公司2家国家级核心育种场的杜洛克核心群后代仔猪，样本总数525头。

1.2 基因检测

1.2.1 样本采集 对525头杜洛克后代仔猪采样，方法是将待检测猪的耳尖用酒精消毒后，用耳号钳剪取耳组织样品2～3 g，放入盛有75%酒精的1.5 mL Eppendorf管内，低温保存。采用常规的苯酚/氯仿/异戊醇法提取基因组DNA，统一稀释至20 ng/L。

1.2.2 基因型判定 PCR引物由上海生工生物有限公司合成。主效基因位点的引物序列及其判型方法见表1。PCR反应体系总体积为20 μL，包括模板DNA 40 ng，10 × buffer 2.0 μL，25 mM MgCl21.2 μL，10 mM dNTP 0.3 μL，Fp 0.4 μL，Rp 0.4 μL，Taq 聚合酶 0.5 μL，超纯水 13.2 μL。PCR 循环参数：94 ℃变性 3 min，94 ℃ 30 s，退火温度（见表1）30 s，72 ℃延伸45 s，共36个循环。

采用PCR-SNaPshot判定MUC13基因型，反应体系为 5 μL，包含 1.5 μL 纯化后 PCR 产物，2 μL SNaPshot multiplexmix（含Taq聚合酶和荧光标记的 dd-NTPs），1.2 μL 去离子水，0.3 μLSNaPshot引物。SNaPshot反应体系的扩增程序为：96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s，25个循环。然后，在SNaPshot反应产物中加0.57 μL 1×NEB buffer和0.1 μL的CIP纯化酶，37℃反应60 min以清除荧光标记的ddNTPs，随后75℃反应15 min灭活纯化酶。最后，每 1 μL SNaPshot 反 应 产 物 加 8 μL Hi-Di formamide与 GeneScan 120 LIZ size standard混合物（两者比例为20：1），经变性后上样于ABI 3130XL遗传分析仪（ABI，USA）进行电泳，利用GeneMapper Software version 4.0（ABI，USA）进行基因型判定和数据收集。

表1 PCR引物及其判型方法

1.3 生长性能测定 将所有经采样进行基因检测的杜洛克仔猪选留，按农业部颁布的《种猪性能测定规程》标准（NY/T 822-2004）进行生长性能测定，测定指标包括生长速度和活体背膘厚。将猪只饲养至85～105 kg时进行称重、同时利用ALOKA 500 B超仪进行活体背膘测量，所测数据录入GBS育种软件，校正到达100 kg体重时的日龄和背膘厚。

2 结果与分析

2.1 MUC13基因的基因频率和基因型频率 所检测525头杜洛克仔猪的MUC13基因型频率及基因频率的分布见表2。

表2 MUC13基因的基因型频率和基因频率

2.2 生长性能测定结果 所有猪只生长测定实际结果及经GPS软件运行校正达100 kg体重日龄与背膘厚结果如表3。经SPSS统计分析，各基因型组间达100 kg体重日龄和背膘厚差异均不显著（P＞0.05）。

3 讨论

1）根据对525头杜洛克仔猪的MUC13基因型检测分析可见，在目前两场的杜洛克种猪群中，仔猪断乳前腹泻抗性基因频率高达0.9以上，纯合抗性基因型频率也达0.832，这与MUC13在福建主要商业猪种［4］及全国引进商业猪种［5］表现基本一致。目前杜洛克生产群的生长性能表现实际上已绝大部分是MUC13抗性基因猪的性能表现。

表3 生长性能测定结果

2）对MUC13不同基因型仔猪进行生长性能测定对比，虽然易感纯合基因型AA猪只达100 kg体重日龄较抗性纯合基因型GG猪平均增加1.56 d，背膘厚也平均增加0.36 mm；易感杂合基因型GA猪只达100 kg体重日龄较抗性纯合基因型GG猪只平均增加1.34 d，背膘厚也平均增加0.27 mm，但经SPSS统计分析，均未达到显著水平（P＞0.05），说明MUC13各基因型猪只间在生长速度和活体背膘上没有显著差别。

3）由于MUC13易感基因A频率较低，易感基因纯合（AA）猪只数量更少，代表性相对较弱，有待于扩大检测和性能测定群体以进一步验证；试验仅对生长速度和活体背膘进行比较分析，至于其余生产性能指标有无影响也有待后续试验加以研究。

［1］ Hejun Li，Yuhua Li，Xiaotian Qiu，et al.Identification and Screening of Gene（s）Related to Susceptibility to Enterotoxigenic Escherichia coli F4ab/ac in Piglets［J］.Asian-Aust J Anim Sci，2008，21（4）：489-493.

［2］ 刘鑫.猪肠毒素大肠杆菌（ETEC）F4受体相关候选基因的筛选与表达研究［D］.长沙：湖南农业大学博士学位论文，2008.

［3］ Ren J，Tang H，Yan X M，et al.A pig-human comparative RH map comprising 20 genes on pig chromosome 13q41 that harbours the ETEC F4ac receptor locus［J］.Journal of Animal Breeding and Genetics，2009，126：30-36.

［4］ 阮国荣，肖石军，徐盼，等.福建省商业猪种MUC13、IGF2和RYR1基因主效位点的遗传变异分析［J］.江西农业大学学报，2012（已接受）.

［5］ Guorong Ruan，Yuyun Xing，Yin Fan，et al.Genetic variation at five loci of RYR1，IGF2，FUT1，MUC13 and KPL2 affecting economically important traits in Chinese commercial pig breeds［J］.Czech journal of animal science，2012（Accepted）.