CD151及其突变体在人脐静脉内皮细胞系中的稳定表达

李鹏程 王 赟 左后娟 邹远林 刘正湘＊

（1华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科，武汉430030；2中国人民解放军95825部队医院，湖北 孝感432111）

CD151是四跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 superfamily，tetraspanins，TM4SF）的重要成员之一，也是近年来被高度关注的一个重要分子。参与细胞多种生理功能的调节，包括细胞迁移、融合、黏附及增殖等［1－3］。越来越多的研究表明CD151在调节内皮细胞粘附、血管形成的过程中发挥着重要的作用，促进体内外血管的形成［4－6］。这些研究均从不同的方面揭示了CD151在多种心血管疾病的发生发展过程中的重要意义。一直以来，在体外研究CD151对内皮细胞粘附、迁移、血管形成、通透性等生物学行为的影响过程中，国内外研究者均采用脂质体介导的内皮细胞基因转染技术，虽然方法成熟，但较为繁琐。本文将CD151基因构建至r AAV载体中形成r AAVCD151重组质粒，用基因定点突变试剂盒分别对野生型CD151基因中整合素结合相关的编码QRD蛋白的序列突变为编码AAA的序列，以及将囊泡运输相关的编码YRLS序列突变为编码ARSA序列，形成r AAV－CD151－AAA突变体，r AAV－CD151－ARSA突变体，并选取已经构建好的r AAV－GFP作对照，分别将其成功转染至内皮细胞中，采用G418对各组细胞进行抗性筛选，成功获得稳定高表达各种不同CD151蛋白的内皮细胞系，以简化后续研究过程，为深入研究CD151的生物学功能奠定基础。

材料和方法

1.材料

1.1 目的质粒和菌种 pZeoSV－CD151质粒由美国Oklahoma大学健康中心张欣教授惠赠。重组腺相关病毒载体的重组体质粒构建为本实验室成熟的技术。

1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶Bam HI、NotI、DNA回收试剂盒、dNTP和DNA Marker、琼脂糖（agarose）、胰蛋白酶（Trypsin）、二甲基亚砜（DMSO）、DNA电泳琼脂糖粉等购于大连宝生物有限公司。基因定点突变试剂盒购于TaKaRa生物有限公司。Fugene－HP转染试剂购于罗氏公司。1640培养基、胎牛血清购于Gibco公司。Transgene质粒小提试剂盒、感受态细胞DH5α购于北京全式金生物技术有限公司。鼠抗人CD151抗体（5C－11）由美国Oklahoma大学健康中心张欣教授惠赠，PVDF膜购于美国Life Science公司。化学发光试剂ECL购于Pirce公司。引物均由奥科生物有限公司设计合成。

1.3 人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）购于武汉大学物种保藏中心。

2.目的基因CD151片段的扩增

以pZeoSV－CD151质粒为模版，使用实验设计好的 引 物，CD151 上 游 For：5＇－GAGATCTATGGGTGAGTTCAACGAG－3＇，包含BglII酶切位点，下游：Rev：5＇－GGAATTCCTCAGTAGTGCTCCAGCTTGAG－3＇包含NotI酶切位点，扩增片段长度为799bp。采用PCR的方法对目的片段进行扩增，PCR反应条件为（20μl）：94℃预变性4min，（94℃变性30sec，55℃退火50sec，72℃延伸50sec）40个循环，72℃延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。

3.重组质粒的构建及鉴定

将PCR获得的目的基因片段用Bam HI、NotI进行双酶切，酶切产物与经过相同酶切的r AAV载体片段进行连接。其中目的基因片段与载体片段的摩尔数比大约为3∶1，在T4DNA连接酶作用下，16℃连接过夜。次日将获得的连接产物转化入大肠杆菌内进行扩增，并进行酶切和测序鉴定。测序所得正向插入的重组体即为r AAV－CD151。随后将CD151基因中与整合素结合相关的QRD位点定点突变为编码三个连续丙酮酸AAA的碱基序列，将与细胞囊泡运输相关的YRLS突变为ARSA。测序后筛选正确的序列，保种。选用r AAV－GFP质粒作阴性对照。

4.内皮细胞稳定转染细胞的筛选

将人脐静脉内皮细胞接种于24孔板中（调整细胞浓度至2.0×105／孔），待板中细胞生长至60－70%融合后，更换opti－MEM培养基，按照DNA∶reagents（μg／μl）2∶5的比例配置转染混合体系，常温下孵育15min，加入细胞培养基中，实验分五组进行（r AAVCD151 组，r AAV－CD151－AAA 突 变 体 组，r AAVCD151－ARSA突变体组，r AAV－GFP组及空白对照组），每组设置3个副孔。转染结束48h后，更换含G418浓度约为800μg／ml的细胞培养液加入各组细胞中，每隔2d更换一次该细胞培养液，连续干预3w，挑选阳性克隆继续培养，并保种及鉴定。

5.Western blot检测CD151蛋白表达

RIPA裂解细胞收集各组细胞总蛋白。配制SDSPAGE凝胶，各组蛋白经浓度测定后，取等量的细胞总蛋白常规电泳，转膜后，37℃牛奶或BSA孵育2.5h；加入鼠抗人CD151单克隆抗体（1∶1000），4℃过夜。洗去一抗加入相应的二抗（1∶5000），常温封闭3h。ECL化学发光法在暗室中曝光。

6.统计学分析

Western blot结果采用灰度分析软件，检测目的条带相对吸光度值，各组数据均用相应的β－actin进行标准化处理。所有数据均采用均数±标准误的方法进行分析，P＜0.05视为有统计学意义。

结 果

1.r AAV－CD151 重 组 质 粒 及 r AAV－CD151－AAA，r AAV－CD151－ARSA 突变体质粒的构建和鉴定

将PCR获得的CD151基因片段用Bam HI，NotI进行双酶切，酶切产物与经过相同酶切的r AAV载体片段进行连接。酶切产物按照3∶1比例在T4DNA连接酶作用下，16℃连接过夜，并将获得的连接产物转化入大肠杆菌内进行扩增，后酶切和测序鉴定。挑选正向插入的序列即为r AAVCD151。采用DNA定点突变试剂盒对CD151基因上整合素结合相关的序列及囊泡运输相关的序列进行定点突变，测序并筛选目的序列（图1－3）。

图3 CD151－ARSA突变体质粒测序结果，阴影部分为突变后的碱基。Fig.3 CD151－ARSA mutant plasmid sequencing results.The shaded stands for the mutated bases.

2.倒置荧光显微镜观察判断转染效率

内皮细胞转染r AAV－GFP质粒作对照，倒置荧光显微镜观察并判断转染效率（图4）。48h绿色荧光蛋白表达最强，转染效率约为40%。

图4 荧光显微镜观察内皮细胞转染r AAV－GFP质粒48h GFP的表达。Fig.4 The p AAV－GFP－transfected HUVECS observed by inverted fluorescence microscopyat 48h.（×200）

3.Western blot检测CD151蛋白表达

Western blot检测各组内皮细胞CD151表达，稳 定 转 染 r AAV－CD151 及 r AAV－CD151－AAA，r AAV－CD151－ARSA 突 变 体 质 粒 的 各 组 细 胞，CD151蛋白表达量显著高于GFP转染组和正常对照组。而稳定转染r AAV－GFP质粒的细胞与正常对照组相比，CD151蛋白表达未见明显改变（图5）。经过数次稳定转染.r AAV－CD151－AAA质粒的各组内皮细胞系CD151蛋白质仍稳定高表达。

图5 western blot检测各组细胞CD151蛋白表达及分析（＊P＜0.05vsGFP组，＃P＜0.05 vs Normal组）Fig.5 Western blot analysis of CD151 protein expression in each group cells.（＊P＜0.05 vs.p AAV－GFP group，＃P＜0.05 vs control group）

讨 论

血管形成是一个及其复杂的病理生理过程，在生命活动中发挥着极为重要的作用。体内血管形成包括血管发生和血管生成。血管发生是指由内皮细胞形成新的血管，而血管生成是指从已有的血管上形成新毛细血管。血管形成包括细胞增殖、分化、内皮细胞黏附、迁移、细胞间接触的形成、ECM的固缩和重建、分支形成或内吸收过程以及血管成熟等多程序事件。无论是机体最初的血管形成还是在原有血管基础上的血管再生，均以内皮细胞网络结构形成为前提。探讨血管形成的调节及相关分子机制对心血管系统疾病的治疗具有重要意义。

CD151是TM4SF的重要成员之一，位于人11号染色体长臂15.5的位置，具有TM4SF的基本特征：四次穿过细胞膜，形成一大一小两个细胞外环状结构，其蛋白质分子的N末端和C末端游离于胞浆中。其细胞外大环上存在整合素结合位点，能够募集整合素分子到细胞连接处，并将整合素接受的各种生物信息传递到细胞内，被称之为整合素分子的“跨膜连接器”。其胞浆内C末端存在囊泡运输相关的靶序列，参与细胞的囊泡循环运输。CD151可能通过与整合素相互作用，参与整合素相关的内皮细胞－细胞间的粘附［7－9］，调节血管形成及稳定性维持。并且在血管形成的调节过程中，囊泡运输也发挥着极为重要的作用。

以往研究中，大都采用脂质体介导的基因转染方法，将CD151基因瞬时转入靶细胞内进行研究，这一方法已十分成熟，且目前在全世界范围内广泛使用。但同时也存在一定的弊端，基于内皮细胞的生物学特性，转染效率不高，并且研究过程若需要对多个靶基因同时进行干预，大大增加了操作的难度。此外，基因的瞬时转染，只能在很短的时间内调控目的基因的表达，实验结果不稳定，一方面不利于长期的干预研究，另一方面可重复性较差。不利于实验过程的控制。

稳定转染内皮细胞系的成功构建，最终可获得外源目的基因片段插入到靶细胞染色体的克隆细胞，能够持续稳定的表达外源目的基因。我们成功构建了特异性稳定高表达野生型CD151基因及其整合素结合缺陷的AAA突变体和囊泡运输缺陷的ARSA突变体基因的人脐静脉内皮细胞系。实验过程中仅需对已保种细胞进行复苏培养，不仅操作十分简便，并且能够长期稳定的高表达目的基因，实验过程条件稳定，易于掌握，可重复性好。值得注意的是，由于载体携带的目的基因片段以及抗生素抗性基因片段的表达不受启动子控制，可单独进行表达，因此，G418筛选后获得的克隆并非完全含有插入的目的基因，需挑选多个克隆分别进行鉴定，之后进行保种。实验中我们对各组细胞分别选取20个阳性克隆进行western blot检测，最终证实正确的各有15个，17个，17个。表达效率分别为75%，85%，85%。将最终获得的细胞保种，于液氮罐中保存。

各种CD151基因型稳定高表达的内皮细胞系的建立，大大简化了实验工作量，降低实验耗费，提高了实验结果的稳定性和可重复性。为研究CD151对内皮细胞各种生物学行为的影响及相关的分子机制奠定了坚实的基础，也为多因素同时干预的研究提供了更有利的保证。最终将为今后更加便捷深入的探讨CD151调节血管形成的过程开辟新的途径。

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