卵巢上皮性癌中MMP－7、VEGF－C的表达和微淋巴管密度变化的相关性及其意义

俞 岚 周 蕾 宋文庆 武世伍 王丹娜

（蚌埠医学院附属第一医院临床病理科；蚌埠医学院病理学教研室；安徽省感染与免疫重点实验室，安徽233030）

在世界范围内，卵巢癌的发病率在女性恶性肿瘤中占3%－4%，是妇科恶性肿瘤导致病人死亡的首要原因［1］。淋巴结转移是卵巢癌重要的转移途径，是卵巢癌临床治疗中一个最棘手的问题，也是造成患者死亡的重要原因。MMP－7（matrix metalloproteinases－7，MMP－7）是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族中分子量最小的一员，为28 k D，具有降解细胞外基质 （extracellular matrix，ECM）的功能，进而提高肿瘤细胞运动能力，参与多种恶性肿瘤的浸润和转移过程［2］。VEGF－C能够促进新生淋巴管内皮细胞的增殖和迁移，增加淋巴管通透性，并利于细胞在淋巴管内移动，因此对于介导肿瘤淋巴管形成和肿瘤转移中起着重要作用［3］。D2－40［4］是近年来发现的一种能与癌胚抗原M2A特异性结合的单克隆抗体，能特异性标记淋巴管内皮细胞，而并不标记血管内皮，是目前阶段淋巴管较好的特异性标记物之一。本研究通过对80例卵巢上皮性癌以及20例良性上皮性肿瘤组织 MMP－7、VEGF－C的表达以及 D2－40标记的淋巴管密度（microlymphatic vessel density，MLVD）进行检测，探讨它们与卵巢癌侵袭、转移以及预后的关系。

材料和方法

1.一般资料

选择蚌埠医学院第一附属医院病理科2000年1月－2002年12月存档蜡块EOC组织标本80例（术前未行放、化疗），所有病例均有完整的临床、病理及随访资料，入选病例随访至患者死亡或截止2010年11月，随访时间为7－96个月。根据UICC2002版PTNM病理分期标准进行分期，早期（FIGOⅠ、Ⅱ期）卵巢癌43例，晚期（FIGO Ⅲ、Ⅳ期）卵巢癌37例；浆液性癌63例，黏液性癌10例，子宫内膜样癌7例；有腹腔脏器及淋巴结转移者38例，有腹水者21例。年龄19－76岁，中位年龄52.0岁，≥60岁33例，＜60岁47例；肿瘤长径D≥6.0cm 48例，D＜6.0cm 32例。选择卵巢良性上皮性肿瘤20例作为对照组。复阅上述患者的病理切片，选取存档标本石蜡块进行切片，厚度4μm。

2.试剂

鼠抗人MMP－7单克隆抗体（克隆系：1D2）及兔抗人VEGF－C多克隆抗体均购自北京中山生物技术有限公司。鼠抗人D2－40单克隆抗体（克隆系：D2－40），Elivision TM plus试剂盒以及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。

3.实验方法

3.1 免疫组织化学Elivision TM plus法

将石蜡标本连续切片，烤干，于二甲苯溶液及不同浓度的乙醇中脱蜡至水洗。免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行。采用已知阳性片作对照，以PBS液代替一抗作空白对照。

3.2 微淋巴管密度（MLVD）计数

D2－40主要表达在淋巴管内皮细胞的细胞浆和细胞膜，从而可以通过D2－40的阳性染色进行MLVD计数，计数方法参照修改过的 Weidner［5］法进行。

4.结果判定

MMP－7及VEGF－C免疫组化阳性染色均为肿瘤细胞胞浆内出现棕黄色颗粒或团块。采取二次计分法：每例标本随机计数5个高倍视野（×400），计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比并计分。首先将染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再将阳性细胞百分比计分，0分为阴性，1分为阳性细胞为＜10%，2分为11%－50%，3分为51%－75%，4分为＞75%。用染色强度得分和细胞数得分的乘积作为判断表达结果，若积分≤2为阴性，＞2为阳性。免疫组化结果由高年资病理医师读片评定。

5.统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。两个样本间均数的比较采用成组t检验，多个样本间均数的比较采用单因素方差分析，各组率的比较采用χ2检验及Fisher exact法检验。各指标间相关性采用Spearman检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.EOC及卵巢良性上皮性肿瘤组织中MMP－7及VEGF－C蛋白的表达

EOC中 MMP－7及VEGF－C表达阳性率分别为60.0%（48／80）、57.5%（46／80）（图1、2），卵巢良性肿瘤组上述指标表达阳性率分别为25.0%（5／20）、25.0%（5／20），两组间 MMP－7及 VEGF－C表达阳性率差异分别具有显著性（P＜0.05）（表1）。

表1 EOC及卵巢良性上皮性肿瘤中MMP－7、VEGF－C及MLVD的表达Table 1 Expression of MMP－7，VEGF－C and MLVD in EOC and benign epithelial ovarian tumor

图1 MMP－7蛋白在卵巢浆液癌中的阳性表达（Elivision TM×400）图2 VEGF－C蛋白在卵巢浆液癌中的阳性表达（Elivision TM×400）图3 卵巢上皮性癌组织周边区淋巴管呈扩张状不规则形，管腔内可见癌栓（Elivision TM×400）图4 卵巢上皮性癌组织中心区淋巴管减少呈闭锁状态（Elivision TM×400）Fig.1 Expression of MMP－7 protein was observed in ovarian serous carcinoma（Elivision TM×400）Fig.2 Expression of VEGF－C protein was observed in ovarian serous carcinoma（Elivision TM×400）Fig.3 The peritumoral lymphatic vessels in EOC，showing irregular－shaped expansion，black arrow is cancer embolus in the lymphatic vessels（Elivision TM×400）Fig.4 Small number of lymphatic vessels showing in the central area of EOC，red arrow is cord－like closed lymphatic vessels（Elivision TM×400）

2.卵巢EOC及良性上皮性肿瘤组织中D2－40标记的MLVD的形态及分布

肿瘤间质内细胞质呈棕黄色的内皮细胞形成的条状、裂隙状结构或者呈现有管腔的结构即为淋巴管。EOC组织与卵巢良性上皮性肿瘤组织中的淋巴管结构以及细胞形态没有明显差异。EOC中，D2－40标记阳性的微淋巴管主要位于癌巢周围的间质内，管壁薄，形状多不规则，管腔内无红细胞成分，有的腔内可见癌栓（图3）。EOC组织癌巢内D2－40标记阳性的微淋巴管数目明显减少，或见到少数管腔受压呈裂隙状的结构（图4）。EOC组织中，D2－40标记的 MLVD为13.09±6.16，良性肿瘤组MLVD为9.25±4.33，两组间MLVD的差异具有显著性（P＜0.05）（表1）。

表2 80例EOC组织中MMP－7、VEGF－C的表达及MLVD与临床病理因素的关系Table 2 Correlation of expression of MMP－7，VEGF－C and MLVD to clinicopathologic indexes of 80 cases of EOC

3.EOC组织中 MMP－7、VEGF－C蛋白的表达及MLVD与临床病理指标的关系

MMP－7、VEGF－C 的 表 达 及 D2－40 标 记 的MLVD数目在EOC中与患者的年龄、肿瘤的组织学类型、肿瘤大小差以及患者有无腹水差异均无统计学意义（P＞0.05）；三个指标的表达在临床分期Ⅲ－Ⅳ期中分别为83.8%、83.8%、16.65±4.15均高于Ⅰ－Ⅱ期39.5%、34.9%、10.02±5.99（P＜0.05），高、中和低分化组 MMP－7蛋白阳性表达率分别为29.4%、56.7%和78.8%，VEGF－C蛋白阳性表达率分别为11.8%、60.0%和78.8%，MLVD计数分别为7.29±2.85、12.63±6.25和16.48±4.94，MMP－7、VEGF－C阳性表达率及MLVD均随着肿瘤恶性级别的增高而显著增加（P＜0.05），有腹腔器官及淋巴结转移者均高于无转移者（P＜0.05）（表2）。

4.EOC中 MMP－7、VEGF－C的表达与 MLVD及淋巴结转移的关系

Spearman相关分析显示，在EOC中 MMP－7的表达阳性组 MLVD为16.23±5.01，MMP－7的表达阴性组MLVD为8.38±4.53，MMP－7的表达与患者MLVD及淋巴结转移呈正相关性（r分别为0.510，0.521，P 均＜0.01）；VEGF－C的表达阳性组MLVD为16.02±5.24，VEGF－C的表达阴性组MLVD为9.12±4.87，VEGF－C的表达也分别与患者MLVD及淋巴结转移呈正相关性。（r分别为0.455，0.565，P均＜0.01）

讨 论

卵巢癌是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因，由于其起病时隐匿，所以75%的患者在就诊时已是晚期阶段，常形成复发和转移，预后较差［6］。作为肿瘤细胞转移的一条主要路线，淋巴管形成成为肿瘤进展的一个重要步骤。临床及实验模型已经证实，淋巴管形成也是卵巢癌恶性进展的关键步骤［7］。因此，寻找到可靠的能够判断患者预后的分子指标并且澄清肿瘤细胞从卵巢播散至区域淋巴结的具体机制迫在眉睫。

基质金属蛋白酶－7（Matrix metalloproteinase－7，MMP－7）也被称为基质溶素，可以特异性的表达于上皮性肿瘤细胞内，而并不表达于间质细胞，与肿瘤的恶性进展密切相关［8］。MMP－7具有强大的EMC降解活性，特异性地降解EMC中的胶原纤维，弹性蛋白，层粘连蛋白，明胶和蛋白多糖等多种重要成分，同时也参与了非EMC蛋白的活化、降解等生化调节过程。由于细胞外基质的降解是癌症发生、发展以及恶性进展的重要步骤，所以MMP－7的表达对于早期阶段肿瘤的侵袭和转移至关重要。不仅如此，肿瘤的发生是一个复杂的综合过程，涉及了肿瘤细胞的生长、凋亡、侵袭、转移以及血管及淋巴管的形成，MMP－7的在人类恶性肿瘤组织过表达，与上述肿瘤发生、发展过程密切相关［9］。多项研究显示，MMP－7的表达与结肠癌［10］、胰腺癌及胆道系统恶性肿瘤［11］的恶性进展相关。同时，大量研究也证实［12－16］，MMP－7可以作为预测肝内胆管腺癌、大肠癌、非小细胞肺癌、口腔鳞状细胞癌及甲状腺乳头状癌等恶性肿瘤患者的独立预后因子。本实验结果显示，MMP－7蛋白阳性表达在临床分期Ⅲ－Ⅳ期显著高于Ⅰ－Ⅱ期（P＜0.01），并且随着肿瘤恶性级别的增高，MMP－7的阳性表达也显著增加（P＜0.01），在伴有腹腔器官及淋巴结转移组高于无转移组（P＜0.01）。这说明，MMP－7在EOC中的表达越高，癌组织的分化越差、分期越晚、越容易伴发转移，这一结果与文献报道具有一致性。MMP－7在有效降解基底膜成分的同时，也能对血管壁及淋巴管壁的弹性蛋白具有很强的分解作用，有文献提示伴有MMP－7高表达的肿瘤细胞更容易突破血管壁和淋巴管壁，促进转移的发生。Graesslin［17］等研究结果显示，子宫内膜癌组织中 MMP－7的高表达与肿瘤淋巴管侵犯之间存在相关性。实验进一步证实了MMP－7的表达上调可能有促进EOC发生淋巴道转移的作用。

长期以来，人们已知很多肿瘤的转移是通过淋巴管进入区域淋巴结而发生的。淋巴管生成被认为是促进肿瘤进展和淋巴结转移的重要因素。在此过程中，血管内皮生长因子家族成员及其受体可能发挥了重要的调节作用。VEGF－C是近年来发现的介导肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移的重要因子之一，VEGF－C与其特异性受体VEGFR－3在体内通过旁分泌的形式相互结合，作用于淋巴管内皮细胞，使其增殖，促进肿瘤的微淋巴管新生，同时通过调节原有淋巴管内皮细胞之间的细胞分泌形式，促进原有淋巴管的增生，并与新生微淋巴管相互吻合形成广泛的淋巴管网，使肿瘤细胞易于通过淋巴管间的吻合进入淋巴管，并转移至远隔部位［18］。近年来有观点认为，恶性肿瘤是全身性疾病，早期即有肿瘤细胞播散进入循环，肿瘤的淋巴结转移是在VEGF－C介导下的主动过程［19］。近年来多项研究证实，VEGF－C的高表达与胃癌［20］、乳腺癌［21］、甲状腺癌［22］及子宫颈癌［23］的侵袭和淋巴结转移相关。Jeon［24］等通过建立人类卵巢癌小鼠模型探讨其腹膜淋巴管特点及腹水形成过程，结果表明VEGF－C在卵巢癌淋巴管形成及重塑中发挥了至关重要的作用。Ueda［25］等研究表明，卵巢癌组织中VEGF－C的表达与肿瘤的临床分期，腹膜后淋巴结转移以及淋巴管生成显著相关性。并且那些能够同时产生VEGF－C和MMPs的肿瘤细胞，具有更加强大的降解EMC及侵入淋巴管的潜能，并最终导致在肿瘤的进展和淋巴结的累犯。Li［26］等通过检测卵巢癌的LVD、瘤内淋巴管数目及淋巴管浸润情况与卵巢癌预后的关系，结果表明淋巴结转移是影响卵巢癌患者疾病进展的重要预后指标和决定临床治疗策略的关键。本实验中，D2－40标记阳性的淋巴管在EOC组织癌巢周围的间质内要明显多于癌巢内，且癌巢内的淋巴管多成受压、闭塞状态。Jain［27］等认为，肿瘤内部的淋巴管由于受到周围不断分裂增殖的肿瘤细胞机械性的压力作用，发生塌陷、萎缩，处于无功能状态，或者由于肿瘤细胞已经侵入并破坏了肿瘤巢团内部的淋巴管网，仅有少数淋巴管内皮细胞残余的结果。本实验发现，随着EOC的分化程度的降低、分期的进展以及淋巴结转移的出现，VEGF－C的表达阳性率与LVD均显著增加（P＜0.01）。同时，VEGF－C的表达分别与LVD及患者淋巴结转移呈现正相关性（r分别为0.455，0.565，P均＜0.01）。本结果表明，VEGF－C可以通过促进EOC患者淋巴管的形成进而增加淋巴结转移的形成。

实验初步探讨了EOC组织中 MMP－7、VEGF－C及D2－40的表达与其淋巴管形成、淋巴结转移的关系。实验结果提示，MMP－7、VEGF－C的表达在促进EOC恶性进展及淋巴结转移过程中可能具有协同作用，联合检测 MMP－7、VEGF－C的表达和 D2－40标记的LVD对卵巢癌高危病例的筛选、判断其恶性程度以及评估患者预后都可能会有重要意义。

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