定位在线粒体的肝刺激因子对线粒体膜电势的影响

张 静 张 静 李胜兰 吴 媛 安 威

（首都医科大学 细胞生物学 肝脏保护与再生北京重点实验室 北京100069）

肝脏是人体非常重要的器官，在体内发挥着消化、吸收、转运、解毒、代谢等重要功能。正因如此，肝脏也同样容易受到各种毒素的损伤。肝刺激因子（hepatic stimulator substance，HSS）［1］是从新生大鼠肝脏中发现并提取出的一种活性物质，可以特异性刺激活化状态下肝细胞（如新生动物肝脏，肝部分切除，肝毒物损伤）的增殖［2，3］。在肝大部分切除术后的小鼠中，HSS也作为肝脏再生与修复的标志之一［4］。有文献表明，HSS对于静息状态下的肝细胞没有刺激作用，但是当它与EGF（或HGF）等生长因子联合使用时，则可明显增强生长因子的作用［5］。基于HSS可放大生长因子的作用效果，故将HSS命名为肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration，ALR）［6］。有文献报导［7］，将 CCl4从小鼠尾静脉注入小鼠体内，造成小鼠肝脏的损伤与纤维化时，ALR基因治疗可以抵抗这种损伤，包括降低线粒体功能障碍，抑制氧化应激，阻止肝星状细胞活化等。线粒体不仅是真核细胞的能量工厂，更参与胞内信号转导的过程，许多研究表明，当机体处于病理或非正常状态下时，线粒体可作为细胞凋亡的感受器或放大器，对细胞生存起调节作用，又被称作细胞的“生死开关”［8，9］。因此，基于 HSS对细胞保护的作用，又与抗凋亡密切相关，但机制尚未清楚，本文将重点放在ALR与线粒体上，旨在观察ALR在亚细胞中的定位，对线粒体膜电势、功能以及形态的影响，为下一步探讨保护机制提供前期的必要条件。

材料和方法

1.主要试剂

BEL－7402：人原发性肝癌细胞系，本室保存；Alexa Fluor 488羊抗小鼠IgG（H＋L）（美国Invitrogen公司）；ATP检测试剂盒（美国Promega公司）；羰基氰化间氯苯腙CCCP（carbonyl cyanide m－chlorophenylhydrazone）（美 国 Sigma 公 司 ）；DMEM （Dulbecco＇s modified Eagle medium）培养基（美国 GIBCO／BRL公司）；DiIC1（5）流式细胞检测试剂盒、Mito Tracker 580染剂（美国 Molecular Probes公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）。

2.细胞培养

野生型BEL－7402细胞（人原发性肝癌细胞系）、600μg G418筛选获得稳定转染空载体BEL－7402／FLAG－pcDNA 3.0 或 FLAG－pcDNA 3.0／h HSS基因的BEL－7402单克隆细胞系，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养，每24－48 h传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

3.免疫荧光（immunofluorescence，IF）

将直径为12 mm，厚0.1 mm的盖玻片放入24孔板，将野生型、转染空载体或HSS基因的BEL－7402细胞按2.5×105／孔接种到24孔板中，24 h后细胞贴壁于玻片上形成细胞爬片；向孔内加入终浓度200 nmol／L的Mito Tracker 580染剂，使线粒体染色，4%多聚甲醛固定后孵育anti－Flag抗体，4℃过夜；Alexa Flour 488羊抗小鼠IgG（H＋L）荧光二抗，于室温避光平缓摇动1h；Hoechst染液（终浓度5μg／ml），将细胞核染色。用小镊子取出细胞爬片，倒扣于载破片上，50%甘油封片；激光扫描共聚焦显微镜进行观察。

4.线粒体超微结构观察

将野生型7402细胞、对照组转染空载体的7402细胞以及实验组转染HSS的7402细胞按2.5×106个接种到直径100 mm的培养皿中，待贴壁后，用15μmol／L CCCP损伤24h，将细胞用胰酶消化，悬浮于PBS收集在1.5 ml EP中，离心后细胞融合成团，用3%戊二醛固定3h，PBS洗涤细胞三次，送电镜室包埋，电镜透射照片。

5.线粒体膜电势（MMP）测定

DiIC1（5）是一种氰化物，可以特异测量线粒体膜电势，当膜电势变化时，染剂在线粒体的积聚浓度会发生变化。细胞用胰酶消化并用PBS悬浮后，加入CCCP（终浓度50μmol／L），37℃作用5min，加入DiIC1（5）使其终浓度为50 nmol／L，之后在37℃度孵箱孵育30min，PBS洗涤细胞两次后，用流式细胞仪检测线粒体膜电势。

6.ATP检测

将野生型7402细胞、对照组转染空载体的7402细胞以及实验组转染HSS的7402细胞按2.5×104／孔接种到 96 孔板中，7.5μmol／L CCCP 37℃作用12h；弃去96孔板中的培养基，加入100 μl新鲜培养基，置于室温平衡30 min；加入100μl的ATP检测试剂盒中附带裂解Buffer，之后充分混匀，避光静置10 min；离心（1，500×g，2min）；将96孔培养板中的样品转移至96孔白光板（200μl／孔）；立即在微孔板化学发光光度仪（luminant microplate reader）检测发光值，记录相对发光强度（每个样品三孔平行）；以试剂盒提供的标准样品做阴性和阳性对照。

7.统计学分析

结 果

1.HSS主要定位于线粒体

如图1所示，蓝色荧光代表细胞核，红色荧光代表线粒体，绿色荧光代表转染入细胞的HSS。图中所见：在转染空载体的7402细胞中，只有红色荧光线粒体而没有绿色荧光HSS的表达；在转染FLAG－pcDNA 3.0／h HSS基因 的 BEL－7402 细 胞中，既有红色荧光线粒体又有绿色荧光HSS的表达，将图像重叠后，红色荧光和绿色荧光几乎完全叠加呈黄色荧光，说明转染入细胞的HSS主要定位于线粒体。

图1 转染的HSS在BEL－7402细胞内表达及定位的激光共聚焦显微镜观察。vector－Tr，转染空载体的BEL－7402细胞；HSS－Tr，转染 HSS基因的BEL－7402细胞。Fig.1 Confocal microscopic observation of expression and localization of h HSS transfected BEL－7402 cells.vector－Tr，transfected with vector in BEL－7402；HSS－Tr，transfected with h HSS in BEL－7402.

2.HSS对线粒体的形态起维持作用

如图2所示，图A为正常的野生型7402细胞，正常的线粒体富含嵴，具有典型的双层膜结构。B、C、D图显示为CCCP损伤后野生组、空载体组以及实验组转染HSS的7402细胞。从图中可以看出，野生组及空载体组在受到线粒体特异性膜孔道开放剂CCCP损伤后，线粒体数量减少，体积变大，线粒体嵴消失、内膜肿胀，而在转染HSS的7402细胞中，线粒体数量以及体积并没有发生明显变化，线粒体嵴存在。由此说明HSS对于线粒体的形态起到了保护作用。

图2 HSS对线粒体超微结构保护作用的电镜观察。A，野生型BEL－7402细胞；B，CCCP损伤后的BEL－7402细胞；C，CCCP损伤后的转染空载体的BEL－7402细胞；D，CCCP损伤后转染HSS的BEL－7402细胞。Fig.2 Electron microsopic observation on HSS protecting morphology of mitochondria.A，wild－type of BEL－7402；B，BEL－7402 plus CCCP；C，vector－transfected BEL－7402 plus CCCP；D，h HSS－transfected BEL－7402 plus CCCP

3.HSS可以稳定线粒体膜电势

CCCP可诱导线粒体膜孔道开放，导致大量线粒体内容物外流，线粒体膜电位（MMP）降低或丧失，用DiIC（5）测定MMP显示其荧光强度降低，流式细胞术检测结果可见峰值左移。图3A是野生组、空载体组以及转染HSS基因的肝细胞，CCCP处理样本（蓝色峰）与对照样本（红色峰）的叠加图，可见CCCP损伤细胞后，野生组及空载体组的荧光强度峰值左移幅度较大，表明MMP下降明显，而转染HSS基因的肝细胞其MMP受CCCP的影响较小，图3B为相对荧光强度统计结果，CCCP作用下，野生型及转染空载体的肝细胞MMP较未处理组降低了61%和59%，而转染HSS基因的肝细胞MMP的下降幅度较小（38%），说明HSS具有稳定MMP的作用。

图3 CCCP对线粒体膜电势的影响。A，线粒体膜电势峰图。红色峰是对照样本，蓝色峰是CCCP损伤样本。vector－Tr表示转染空载体BEL－7402细胞，HSS－Tr表示转染HSS的BEL－7402细胞。B，相对荧光强度统计结果。＊P＜0.05Fig.3 The effect of CCCP on MMP.A，Histogram of MMP.Red line stands for control samples，blue line stands for CCCP injured samples.vector－Tr，transfected with vector in BEL－7402；HSS－Tr，transfected with h HSS in BEL－7402.B，relative fluoresence intensity.＊P＜0.05

4.HSS抑制细胞中ATP的下降

为了观察CCCP诱导细胞凋亡后，线粒体的能量产生状况，用荧光素酶法检测细胞内ATP的含量。如图4所示，当用CCCP分别损伤野生组、对照组以及转染HSS组的7402细胞后，细胞内ATP水平显著下降，但过表达HSS组ATP的含量比野生组及空载体组细胞多约30%，具有统计学意义，说明HSS对细胞内ATP的贮存起重要的维护作用。

图4 细胞内ATP水平.＊P＜0.05Fig.4 Intracellular ATP level.＊P＜0.05

讨 论

线粒体为双层膜结构包裹的细胞器［10］，而线粒体内膜对离子、小分子物质的通透性有严格的选择性，由于屏障结构的存在，使内膜两侧形成电势差，即线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP），膜电位的形成为氧化磷酸化实行提供必要条件［11］，这对于线粒体结构和功能有重要意义。换言之，线粒体的功能依赖于线粒体两侧膜电势的维持。当凋亡因子作用于机体，线粒体内膜非特异性孔道产生，细胞色素c从内膜脱落并流失到胞质中，Bax表达，半胱天冬酶（caspase）活化等现象，这些都是启动细胞凋亡的因素，Bcl－2、Bcl－XL等分子的表达则可以抑制线粒体活性氧的生成和阻止细胞凋亡的发生［12，25］。线粒体膜孔道复合体（mitochondrial permeabilization transition pore，MPTP）位于线粒体内、外膜之间，是由许多蛋白所组成的复合孔。其中主要的是这三种蛋白：外膜的电位依赖性阴离子通道（voltage dependent anion channel，VDAC），内膜的腺苷酸转位酶（adenine nucleotide translocase，ANT），以及基质的亲环蛋白D（cyplophilin D，Cyp－D）。生理状态下 MPTP的周期性开放，防止外室正离子过度蓄积，以维持线粒体内电化学平衡态，保持氧化还原通路通畅。当膜孔道过度开放，则会导致膜电势持续下降，发生线粒体膜电势转换（mitochondrial permeability transition，MPT），线粒体内物质流出，启动细胞凋亡［13－15］。由于孔道对小于15 KD的大分子均可通过，H2O及小分子将到达基质，导致基质膨胀而使线粒体内膜嵴被拉直，外膜破裂，如果这种线粒体数量增加，在胞质中释放出的可溶性蛋白浓度达到一定阈值，就会启动核凋亡的产生［16］，有报道指出，MPTP与电控离子通道上的VDAC相关，其开放是凋亡的早期事件［17］。所以，稳定MMP，抑制MPTP的发生，可以在一定程度上防止凋亡的发生，从而保护细胞免受毒素的影响。有报导称［18］，ALR与氧化呼吸链也有密切联系，以二硫苏糖醇（DTT）为还原底物，细胞色素C作为HSS的电子受体催化速率是氧的100倍。不仅如此，在体内的研究中，也有文献报道ALR可以保护小鼠肝脏免受CCl4、氨基半乳糖等毒物肝脏的特异性损害［19－21］。此外，ALR能够增加线粒体基因的表达，增加细胞色素c的含量，也能增强肝脏线粒体的氧化磷酸化活性［22］。ALR和氧化还原调节受体——Mia40／Tim40都是二硫化物转导系统的成员，即均可介导多种蛋白质定向转导进入线粒体的膜间隙［23，24］。在肝脏修复过程中，充足的Fe／S蛋白是有利于受损细胞的修复。

从我们研究的数据看，转染入细胞中的肝刺激因子大部分定位于线粒体，少部分定位于胞浆及胞核。羰基氰化间氯苯腙（carbonyl cyanide m－chlorophenylhydrazone，CCCP）能造成线粒体膜孔道通透性瞬间开放，使线粒体通透性转换（mitochondrial permeability transition，MPT），MMP降低，从而引发细胞凋亡。本实验中当用CCCP分别损伤野生组BEL－7402细胞、转染空载体的BEL－7402细胞以及转染HSS的BEL－7402细胞后，在形态学方面，HSS可以维持线粒体的基本形态结构，没有发生野生组出现的线粒体肿胀现象；在功能方面，HSS可以维持细胞内ATP水平；在稳定膜电势方面，作用突出。由此表明，肝刺激因子在细胞中主要定位于线粒体，保护肝细胞免受毒素损伤与维持线粒体膜电势（MMP）密切相关。

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