外周血树突细胞功能与银屑病发病的关系

刘丽娟 宋适恒 李 鑫 蔡 丽 李艳佳 (河北医科大学第一医院皮肤科，河北 石家庄 05003)

银屑病俗称牛皮癣，是一种常见的红斑鳞屑性皮肤病〔1〕，具有多基因的家族遗传性〔2〕，是一种原因未明的慢性皮肤病，但具体发病机制仍未清楚。银屑病具有治疗困难、易复发等特点，严重影响病患的生活质量〔3～6〕。目前研究发现，其发病与机体的免疫功能密切相关〔7，8〕。树突细胞(DCs)是体内“专职的”抗原呈递细胞(APC)，是体内唯一能够激活“初始型”免疫反应的细胞，对机体免疫功能的调节起着重要的作用。本实验拟探讨银屑病患者外周血DCs功能与银屑病发病的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 寻常型银屑病门诊患者50例，其中男22例，女28例，年龄20～58〔平均(39±17.6)〕岁，均为进行期患者，就诊前至少2个月内未用过皮质类固醇和免疫抑制剂治疗。正常健康对照组为医院职工和学生志愿者共50例，其中男20例，女30例，年龄21～52〔平均(36±11.2)〕岁。抽血前均征得患者和志愿者的同意。

1.2 主要仪器及试剂 Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司。鼠抗人CD80-FITC单克隆抗体(MAB104)、鼠抗人CD83-FITC单克隆抗体(HB15a)，美国Beckman Coulter公司。IL-12 ELISA试剂盒，上海西唐生物科技有限公司。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重组人白介素-4(rhIL-4)，PEPROTECH Asia公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血DCs的制备 取银屑病及正常健康人外周静脉血5 ml(肝素抗凝)，使用淋巴细胞分离液常规方法分离制备外周血单个核细胞(PBMC)。生理盐水洗涤细胞3次。用含15%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×109个/L，加入到6孔培养板中(3 ml/孔)，放入37℃和5%CO2培养箱中培养3 h后，弃去培养液，用37℃预温的 RPMI1640培养液轻轻洗去未贴壁的细胞，获得的贴壁细胞即为拟诱导DCs的单核细胞(因为单核细胞在细胞培养时具有短时贴壁的能力)。向6孔板中每孔贴壁细胞中加入含有15%胎牛血清、50 μg/L rhIL-4和rhGM-CSF细胞因子的RPMI1640培养液3 ml，放入37℃和5%CO2培养箱中培养，隔日半量换液(吸出30%，加入60%)。同时补充相应的细胞因子。每次换液吸出的培养液均用离心机离心保留培养液中悬浮的细胞。培养6 d后收集悬浮的细胞，即诱导的DCs，同时收集细胞培养液检测IL-12水平。

1.3.2 流式细胞术检测DCs表型 将收集的DCs用生理盐水洗涤2次，调整细胞浓度为1×1010个/L，每例标本取细胞悬液0.4 ml分别放入4个试管(0.1 ml/管)，分别加入 CD80、CD83及相应的同型对照抗体。混匀后，室温避光放置30 min，生理盐水洗涤2次，加入1 ml生理盐水，上流式细胞仪检测。

1.3.3 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测DCs分泌IL-12水平取在诱导DCs实验中收集到的细胞培养液，利用常规的ELISA方法检测IL-12水平，具体操作步骤按照IL-12 ELISA试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件包进行t检验，计量资料采用±s表示。

2 结果

2.1 DCs培养及其形态 人外周血分离的单个核细胞在37℃和5%CO2培养箱中孵育3 h后于倒置显微镜下观察到细胞开始贴壁，并有聚集成团的现象，且贴壁细胞形态不规则，少数有树突状突起;培养第2～3天可见细胞分散，细胞体积增大，多数细胞有明显的树突状突起，并有少数细胞呈悬浮状态生长;培养第6天，仅有一小部分细胞贴壁生长，大部分细胞呈悬浮状态生长，即所需要的DCs。

2.2 流式细胞术方法检测DCs中CD80及CD83表达水平银屑病患者外周血中DCs上CD80及CD83的阳性表达率分别为(75.15±2.76)%、(72.43±1.94)%，显著高于正常健康人外周血中 DCs上 CD80及 CD83的阳性表达率(57.88±3.21)%、(41.86±2.54)%(P ＜0.01)。

2.3 ELISA检测DCs分泌IL-12细胞因子含量 银屑病患者外周血DCs分泌IL-12细胞因子含量(282.80±23.26)，显著高于正常健康人外周血DCs分泌IL-12细胞因子含量(191.64±15.55)(P＜0.01)。

3 讨论

银屑病是一种常见的红斑鳞屑性皮肤病，发病机制目前尚未阐明，但多数研究认为其与机体免疫功能密切相关，可能是一种T细胞介导的自身免疫性疾病〔9〕。越来越多的研究集中在Th细胞功能异常与银屑病的关系上〔10〕，研究显示，银屑病患者免疫系统Th1/Th2平衡紊乱，其中Th1更占优势〔11〕。

DCs是一组具有可塑性的非淋巴样单核细胞，在体内分布极为广泛，是目前已知功能最强的APC，来源于骨髓造血干细胞，以未成熟的形式存在于循环系统中并广泛分布于外周组织。外周血中存在几种DCs前体细胞，单核细胞、类浆细胞DC(pDC)，郎格汉前体细胞，其中单核细胞可分化为髓系DCs。外周血及组织中的未成熟的DCs受到刺激并迁移至二级淋巴组织中成为成熟的DCs，在此过程中其细胞表型也发生了很大的变化，DCs成熟标志物CD83表达量逐渐增多，并分泌多种细胞因子(如IL-4、IL-10、IL-12等)，从而调控机体免疫功能。

PBMC在rhGM-CSF及rhIL-4诱导下可向DCs分化。CD80被认为是DCs表面标志，常用于监测DCs的表达，CD83是成熟DCs的特异标志物。本实验中检测银屑病患者PBMC在细胞因子rhGM-CSF及rhIL-4诱导下向DCs分化能力较正常健康人增强，DCs中CD80及CD83表达率显著增高，提示银屑病患者DCs表达及活化程度发生紊乱，导致机体免疫功能紊乱。而且，银屑病患者DCs分泌IL-12表达量显著高于正常健康人，IL-12表达量的异常增高，引起Th1/Th2平衡紊乱，使Th1占优势，从而引起银屑病的发生，调控DCs的功能将有助于银屑病治疗。

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