Endoglin蛋白对恶性胶质瘤内皮细胞的影响

王 丹 (辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847)

恶性胶质瘤是老年患者中最为常见的原发性肿瘤〔1〕，其感染部位特殊且极具侵袭性，通过手术或放/化疗均不能取得理想的效果，因此复发率高、生存期短〔2〕。新生血管是肿瘤增殖的基础，也是侵袭和转移的根基，同时胶质瘤也是血管化程度最高的肿瘤之一，因此靶向抑制胶质肿瘤血管生成是目前研究的热点〔3〕。Endoglin蛋白是近年来发现的，在肿瘤血管内皮细胞生成过程中特异性高表达，因此成为了一个很有前景的生物靶分子〔4〕。本文通过干扰Endoglin的表达，研究其对胶质瘤内皮细胞的影响，为开拓胶质瘤血管治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 新鲜的恶性胶质瘤组织取自我校附属医院外科手术切除的标本，在手术室无菌环境下取材后放入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡并送到细胞室，分离内皮细胞进行试验准备。

微血管内皮细胞培养基(EGM-2-MV)BulletKit试剂购自Lonza公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，胰蛋白酶、谷氨酰胺、二甲基亚砜、焦炭酸二乙酯购自Sigma公司，RNAiso Reagent、RT-PCR试剂盒、DNA Marker购自 TaKaRa公司，其余试剂均为国产分析纯。常用的细胞培养试剂及溶液均为实验室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将分离出来的内皮细胞置于EGM-2-MV培养基中适宜条件培养，待细胞长至85%时从恒温培养箱中取出吸去培养液，加入PBS震荡后弃去，加入胰蛋白酶消化液，在镜下观察，当细胞皱缩并且逐渐变圆时加入终止液停止消化，将培养基注入离心管内，1 000 r/min离心5 min，弃上清加PBS重新1 000 r/min离心5 min，弃上清后加入培养基重悬细胞，将传代细胞置于各个新培养基中继续培养。

1.2.2 细胞生长曲线测定方法 将上述传代细胞制成细胞悬液，将细胞浓度稀释至2×104/ml，设3个复孔，每个孔在开始试验前2 h内加入10μl的胆囊收容素八肽(CCK-8)溶液，之后每孔加入100μl细胞悬液，放入培养箱中继续培养，用酶标仪在450 nm处测量每个孔的吸光度，连续测量1 w做出生长曲线。

1.2.3 慢病毒转染及检测方法 将含有绿色荧光蛋白(GFP)荧光标记基因的Endoglin-shRNA慢病毒液进行扩增，将空病毒载体作为对照液，选择生长情况良好的传代细胞进行转染，转染时共分为三组:沉默组(加Endoglin-shRNA)、对照组(加对照液)、空白组(未进行病毒感染)，48 h后用倒置荧光显微镜观察，估计慢性病毒感染效率并计算Endoglin基因的沉默率，将三组细胞进行消化成单细胞，利用PBS洗涤和重悬后再用流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例。

1.2.4 总RNA鉴定 将细胞的胞内总RNA按常规方法提取后用超纯水将RNA稀释50倍，用紫外分光光度法测量260 nm和280 nm处的OD值，测量结果×50则为RNA实际浓度，用琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性鉴别。

1.2.5 qPCR 将分离出的RNA混入实时PCR管内，按照95℃ 5 min→(95℃ 30 s→65℃ 30 s→75℃ 30 s→90℃ 30 s)×40次→65℃ 10 min循环1次，将扩增产物加入内切酶酵解。

1.2.6 Western印迹 将细胞裂解后提取细胞总蛋白，以标准FBS为对照测量蛋白质含量，按照十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶(SDS-PAGE)电泳方式在95 V下进行电泳，电泳结束后在50 V下转膜1 h，转移成功后用超纯水洗去脱色液，将蛋白膜用Tris盐酸缓冲液(TBS)浸润后封闭振摇1 h，将一抗用TBST稀释后浸润于膜蛋白上，过夜孵育，将二抗与蛋白膜接触常温孵育1 h，再用TBST振摇清洗两次，TBS清洗1次，将化学发光液均匀涂于蛋白膜上进行图像采集分析。

1.2.7 划痕试验 将细胞置于24孔板内，平铺细胞至完全融合，用小枪头从中间划一刀线，换液时去除擦下的细胞，使用活细胞工作站连续观察细胞迁移过程，每隔20 min进行一次图像采集，连续采集30 h。

1.2.8 Matrigel小管形成 在冰浴环境下溶解Matrigel，按每孔30μl加入96孔板内，于37℃孵育30 min，稀释细胞悬液为5×104/ml后每个孔内加入100μl，置于适宜环境中培养72 h后镜下观察。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0软件行t检验。

2 结果

2.1 恶性胶质瘤内皮细胞生长特征 培养基中的恶性胶质瘤内皮细胞呈单层贴壁生长，通过倒置显微镜观察发现活细胞呈不规则梭形或多边形，卵圆细胞贴壁，细胞内含有丰富的胞浆，在梭形细胞内常见多个核仁，相邻细胞膜有融合现象。

2.2 恶性胶质瘤内皮细胞慢性病毒干扰率检测结果 倒置荧光显微镜联合流式细胞检测结果发现沉默组感染率达到93%，感染效果理想。将三组进行qPCR扩增检测显示沉默组Endoglin mRNA表达较对照组和空白组明显下调，通过Western印迹检测也发现沉默组Endoglin蛋白下调明显，提示慢病毒转染后沉默效果理想。

2.3 内皮细胞对血管内皮细胞生长因子(VEGF)刺激反应检测结果 三组细胞在常规培养下增殖无明显变化，但用外源性VEGF刺激后沉默组增殖率明显低于其余两组，且沉默组的VEGF受体(VEGFR2)表达未增加，另外两组VEGFR2表达量显著增加(P＜0.01)，由此提示Endoglin基因可能会直接影响VEGFR2的表达。

2.4 划痕试验检测结果 沉默组细胞与对照组比较细胞迁移速度明显变慢，迁移数量也明显减少(P＜0.05)，提示Endoglin蛋白可能会直接影响细胞迁移情况。

2.5 Matrigel小管试验检测结果 对照组在Matrigel培养中互相连接形成明显的条索状，最终形成了初步的小管样结构，沉默组内皮细胞形成小管的能力明显减弱，在镜下观察仅形成初级条索状未能形成成形的小管结构，与对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，提示Endoglin基因可能和新生血管形成有直接联系。

2.6 苯质金属蛋白酶(MMP9)、MMP2、趋化因子苯质细胞衍生因子受体(CXCR4)变化检测结果 通过qPCR检测发现沉默组和对照组在MMP9、CXCR4表达方面无显著性差异(P＞0.05)，但沉默组MMP2的表达明显消弱，和对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)，同样提示Endoglin基因可能和新生血管形成有直接联系。

3 讨论

Endoglin蛋白是180 kD同型二聚体细胞膜糖蛋白，其编码基因Endoglin位于人染色体9q34内，共含有633个氨基酸。Endoglin蛋白有L/S两种异构体，其主要区别在于氨基酸组成方式不同〔5〕。Endoglin蛋白是转化生长因子(TGF-β)受体复合物的一个辅助成分，在体内主要参与调节细胞增殖、分化、迁移等与细胞形成相关的过程，在内皮细胞上的表现多体现在激活内皮细胞增殖。近年来研究发现Endoglin蛋白对血管发育有极其重要的作用，曾有研究人员敲除小鼠Endoglin基因，结果发现小鼠在受孕15 d内均死于心血管发育缺陷〔6〕。另有研究〔7〕指出在人胚胎期4～8 w时，Endoglin基因高表达造成Endoglin蛋白在内皮细胞上含量较多，而人胚胎期4～8 w内为心血管快速发育时期。本研究结果提示Endoglin基因对内皮细胞增殖作用有显著调节性，通过MMP2含量下降也可以印证上述观点;另外，Endoglin基因在血管形成方面起着极其重要作用，且能够通过影响血管生成进而影响细胞迁移。

通过本次研究发现Endoglin蛋白是抗击恶性胶质瘤的理想靶点，其对内皮细胞的影响比目前治疗方案更为直接且联系更为紧密，为后续研究奠定了分子基础。

1 张艳春，齐 玲，严 海，等.TRAIL与环磷酰胺诱导LN215细胞凋亡的作用〔J〕.中国老年学杂志，2012;32(18):3943-4.

2 沈维高，王跃华，缪春明，等.羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA对鼠胶质瘤C6细胞的促凋亡效应〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2012;13(1):53-7.

3 Gougos A，Letarte M.Identification of a human endothelial cell antigen with monoclonal antibody 44G4 produced against a pre-B leukemic cell line〔J〕.Immunology，1998;121(6):1925-33.

4 Sachdeva G，D'Costa J，Cho JE，et al.Chimeric HIV-1 and HIV-2 lentiviral vectors with added safety insurance〔J〕.JMed Virol，2007;79(2):118-26.

5 Perez-Gomez E，Eleno N，Lopez-Novoa JM，et al.Characterization of murine S-endoglin isoform and its effects on tumor development〔J〕.Oncogene，2005;24(27):4450-61.

6 Arthur HM，Ure J，Smith AJ，et al.Endoglin，an ancillary TGFbeta receptor，is required for extraembryonic angiogenesis and plays a key role in heart development〔J〕.Devel Biol，2009;217(1):42-53.

7 Qu R，Silver MM，Letarte M.Distribution of endoglin in early human development reveals high levels on endocardial cushion tissue mesenchyme during valve formation〔J〕.Cell Tiss Res，1998;292(2):333-43.