α-萘酚-硫酸法测定酒糟多糖含量

张世仙，刘 焱，朱 彬，金 茜，曾启华

(遵义师范学院化学化工学院，黔北特色资源应用研究实验室，贵州 遵义 563002)

多糖是由10个以上的单糖分子通过糖苷键结合而成的物质，多糖是一切有生命的有机体必不可少的成分，是构成动植物骨架结构的组成成分，多糖与维持生命的种种生理机能密切相关。研究发现多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老，有些多糖具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血压、镇痛、抗辐射等药效[1-5]。贵州省是酿酒大省，大多数白酒是用当地生产的高粱和小麦为原料通过酒曲发酵而成，其最大副产物——酒糟中残存着大量的多糖、被富集的蛋白质、矿物元素等营养物质[6-7]，是提取酒糟多糖的较好原料。

对多糖的定量测定可以采用两种方法[8-17]：一是利用多糖中的还原糖与试剂发生氧化还原反应显色测定，如3,5-二硝基水杨酸盐(DNS)比色法和Somogyi-Nelson法；二是将多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质进行测定，如苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。其中苯酚-硫酸法是常用的一种经典方法，但是苯酚毒性大、易氧化，其提纯操作较难控制，文献[18]报道用萘酚-硫酸法测定白果多糖的含量，方法可行和容易操作。本实验尝试用a-萘酚-硫酸法测定酒糟多糖的含量，以建立酒糟多糖含量的测定方法和实验技术。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

酒糟 贵州省某酒厂提供；α-萘酚(分析纯) 湘中化学试剂开发中心；葡萄糖(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇(分析纯)、浓硫酸(分析纯) 成都市科龙化工试剂厂。

722型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；TB-214型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；pHS-2C型精密酸度计 上海大普仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；0412-1型离心机上海手术器械厂；真空冷冻干燥机 美国Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 酒糟多糖的提取工艺[19-22]

新鲜酒糟粉→在料水比1∶12条件下，用盐酸调pH值至5.0～5.5→控制温度用水解蛋白酶降解酒糟中的蛋白质→离心→pH值调至中性→浓缩→4倍体积95%乙醇沉淀→静置→过滤→冷冻干燥→酒糟多糖

1.2.2 溶液配制

葡萄糖标准溶液：精密称取105℃干燥至质量恒定的葡萄糖标准品20mg，用二次蒸馏水定容至500mL，即得葡萄糖标准贮备液。

样品溶液：精密称取样品0.2200g，用二次蒸馏水定容至50mL，移取10mL，用二次蒸馏水定容至100mL，即为0.44mg/mL待测样品溶液。

1.5g/100mLα-萘酚溶液：准确称取1.5gα-萘酚，用体积分数30%乙醇溶液溶解并定容至100mL，即为1.5g/100mLα-萘酚溶液，转移至棕色瓶，于4℃冰箱保存、备用。

1.2.3 最大吸收波长确定

准确移取1mL 0.1mg/mL葡萄糖标准溶液于25mL比色管中，加入1mL 1.5g/100mL的α-萘酚溶液，摇匀并迅速加入5mL浓硫酸，充分混合，室温放置至无气泡后(约20min)，在410～710nm波长区域测定吸光度，并以试剂空白为对照。

1.2.4 标准曲线的绘制

准确移取葡萄糖标准溶液10、15、20、30、35、40、45mL于50mL容量瓶中定容，得系列质量浓度的标准溶液。按1.2.3节方法实验，于560nm波长处，以试剂空白为参比测吸光度。

1.2.5 换算因子的测定[12-14]

准确移取1.2.2节中的样品溶液1mL，用二次蒸馏水定容于10mL容量瓶中。取1.0mL溶液5份，按1.2.3节方法实验，测定吸光度，由回归方程计算多糖中葡萄糖平均含量，按下式(1)计算出换算因子f。

式中：m为多糖质量/mg；ρ为样品溶液中葡萄糖的质量浓度/(μg/mL)；D为多糖的稀释倍数；V为体积/mL。

1.2.6 样品测定

准确移取1mL质量浓度为0.44mg/mL样品溶液3份，按1.2.3节方法实验，测定吸光度，由回归方程计算葡萄糖含量，按式(2)计算得出酒糟多糖含量。

式中：W为样品的质量/mg；其他量符号含义同式(1)。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长确定

取一定量的葡萄糖标准液，按1.2.3节方法实验所得的吸收曲线见图1。从图1可见，最大吸收峰波长为560nm。

图1 α-萘酚-硫酸法确定多糖最大吸收波长Fig.1 The maximum absorption wavelength for naphthol-vitriol photometric determination of polysaccharide

2.2 标准曲线的测定

根据1.2.4节方法，以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为A=0.0255ρ＋0.0419，R2=0.9975，葡萄糖在6～36μg/mL之间呈良好的线性关系。

2.3 测定方法的考察

2.3.1 显色时间的确定

准确移取1mL样品溶液，按1.2.2节方法实验，每隔10min测定1次吸光度，连续测定50min，结果见图2。

图2 显色时间对吸光度的影响(n=3)Fig.2 Effect of coloration time on absorbance (n=3)

由图2可见，冷却至室温后的20min内吸光度很稳定，30min后吸光度虽然有所下降，但下降趋势不明显，因此按1.2.2节方法实验的时间控制在20min之内。

2.3.2α-萘酚溶液添加量的确定

在盛有1.0mL一定质量浓度的葡萄糖标准溶液的5支比色管中，各加入1.0mL二次蒸馏水和1.5g/100mL的α-萘酚溶液0.2、0.6、0.8、1.0、1.2mL，再分别加入2.5mL浓硫酸，另取一支比色管作空白，按1.2.2节方法实验并测定吸光度。结果表明，当1.5g/100mL的α-萘酚溶液加入量为1.0mL时，吸光度较大，见图3。

图3 α-萘酚添加量对吸光度的影响Fig.3 Effect of α-naphthol dosage on absorbance

2.3.3α-萘酚溶液质量浓度的确定

取6支比色管，分别加入1.0mL一定质量浓度的葡萄糖标准溶液，再分别加入质量浓度为0、0.500、0.750、0.875、1.500、1.750g/100mL的α-萘酚溶液，按1.2.2节方法实验并测定吸光度。结果表明，使用1.500g/100mLα-萘酚溶液，吸光度最大，见图4。

图4 α-萘酚质量浓度对吸光度的影响Fig.4 Effect of α-naphthol concentration on absorbance

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验

准确移取1mL 一定质量浓度的葡萄糖标准溶液于11支比色管中，加双蒸水1.0mL，再加入1.0mL 1.5g/100mL的α-萘酚溶液，按1.4.3节方法实验，连续测定11次，得吸光度分别为0.904、0.898、0.900、0.900、0.898、0.899、0.901、0.900、0.899、0.900、0.899，计算RSD为0.18%。

2.4.2 重复性实验

准确量取1mL 0.44mg/mL的样品溶液于8支比色管，按1.2.2节方法实验，得吸光度分别为0.686、0.686、0.685、0.684、0.686、0.686、0.684、0.685，计算RSD为0.14%。

2.4.3 加标回收率实验

准确量取2mL 0.44mg/mL的样品溶液于10mL容量瓶中，用二次蒸馏水定容至刻度，取1mL按1.2.3节方法实验，测得吸光度，换算含糖量平均值为0.945μg/mL。再取4支10mL容量瓶，各加入2mL该样品溶液，并分别加入一定量的葡萄糖标准溶液，用二次蒸馏水定容至刻度，取1mL按1.2.3节方法进行实验，结果见表1。

表1 回收率测定结果(n=4)Table 1 Recovery rates of glucose from spiked sample (n=4)

从表1可见，平均回收率为100.65%，RSD为6.5%。2.4.4 换算因子的测定

实验测得1.2.5节中样品溶液的吸光度为0.585、0.585、0.593、0.588、0.586。由回归方程计算出酒糟多糖中葡萄糖平均含量为21.392μg/mL，按换算因子公式计算出f＝2.057(n=5)。

2.5 样品测定

将1.2.6节实验测得的吸光度代入回归方程计算葡萄糖含量，再通过多糖含量公式计算得出酒糟多糖平均含量为10.6%，RSD为4.0%(n=3)。

3 结 论

α-萘酚-硫酸法测定酒糟多糖含量实验表明：样品与5mL浓硫酸反应，用1.5g/100mLα-萘酚1.0mL显色，于560nm波长处测定其吸光度，实验结果较稳定，回收率较高。

α-萘酚-硫酸法与常用的苯酚-硫酸法相比，测定酒糟多糖含量的步骤基本一致，但是α-萘酚-硫酸法在操作、试剂消耗等方面更具优势，适合酒糟多糖含量的测定。

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