蛋清肽的工艺优化、抗氧化作用及特性

周向军 ， 吴红艳 ， 颜彩映 ， 穆青山 ， 张 继 *，2

（1.天水师范学院 生命科学与化学学院，甘肃 天水741001；2.西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州730070）

蛋清蛋白质（egg white protein，EWP）不仅来源丰富、营养价值高、具有起泡性、乳化性及凝胶性等多种功能特性，而且其氨基酸组成与人体相似，因此可被人体全面吸收[1]，目前被广泛应用于火腿、腊肠及面制品生产中[2]。但EWP含有蛋白酶抑制因子、维生素结合蛋白及过敏性蛋白等不利因素[3]，限制了其大范围应用。在食品加工行业，很大一部分蛋清被作为废弃物丢弃，不仅浪费了目前较为紧缺的蛋白质资源，而且还易造成环境污染[4]，因此EWP的进一步改性显得十分必要。大量研究表明，通过控制水解度使EWP酶解生成的小肽，其不仅有利于人体吸收[5]、致敏性更低，还有可能提供潜在的生物活性[6-7]，如降血压[8]、抗凝血、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、降血脂等功能[9]，这进一步提高了EWP的附加值，开辟了鸡蛋清深加工的新途径。王莹、陈栋梁等研究表明，蛋清肽对小鼠具有增强免疫功能[10-11]，丁红军、朱艳华等探讨了芝麻及玉米肽的生物活性[12-13]。作者探讨风味蛋白酶水解EWP生成抗氧化肽的最佳工艺、抗氧化作用及其特性，为EWP在食品、医药保健领域开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.5 MG AS1.398中性蛋白酶、Flavorzyme风味蛋白酶及Alcalase FG 2.4 L碱性蛋白酶:均为诺维信产品；胰蛋白酶、DPPH:为Sigma产品；其余均为分析纯。

茚三酮显色剂:茚三酮0.5 g，果糖0.3 g，10 g磷酸氢二钠及6 g磷酸二氢钾定容至100 mL。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶活性测定 参考SB/T 10317-1999及福林-酚法[14-15]测定蛋白酶活性。酶活定义为:1 g固体或1 mL液体蛋白酶，在一定温度和pH下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个活力单位，以U/g（U/mL）表示。一定质量或体积的酶，溶解定容至一定体积 （使测定光密度值在0.1～0.8范围内）。1 mL酶液在各最适温度条件下预热5 min，加入同样温度预热的蛋清1 mL，反应10 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸 （TCA）终止反应，3 500 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加入 0.4 mol/L Na2CO3溶液5 mL，福林试剂 1 mL，40 ℃显色 20 min，660 nm 测光密度值，同时做空白对照。

1.2.2 酪氨酸及甘氨酸标准曲线的制作 酪氨酸标准曲线见图 1 （a），Y=0.003 66+13.359 65X，R2=0.998 6，酪氨酸在0.01～0.1 mg范围内，线性良好，可用于酶活测定。甘氨酸标准曲线见图1（b），Y=0.039 3X-0.039 21，R2=0.995 29，甘氨酸在 4～24 μg范围内，线性良好，可用于蛋清肽溶解性测定。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

1.2.3 蛋白酶的初筛 在相同蛋清体积分数（蛋清与水的体积比）、酶活、酶解时间及各酶最适温度和pH条件下进行酶解以初筛。取一定体积的蛋清，在推荐的温度下，调节至各最适pH，加酶保温250 min，TCA终止反应，离心，取上清液稀释一定倍数，测定对DPPH自由基清除率。

1.2.4 蛋白酶作用条件的复筛 对初筛的蛋白酶通过单因素和正交试验，确定最适酶解条件。单因素试验:分别在不同酶活、温度、蛋清体积分数及pH条件下进行对DPPH自由基清除率的测定。正交试验:以确定的酶活、温度、蛋清体积分数及pH进行 L9（34）正交试验。

1.2.5 抗氧化试验

1）蛋清肽对DPPH自由基的清除。取酶解液0.2 mL于试管中，用水补至2 mL，混匀，加入2 mL 0.04 g/L DPPH无水乙醇溶液，混匀，室温暗处反应20 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液在517 nm处测其光密度值为Ai；另取0.2 mL样液于试管中，用水补充至2 mL，混匀，加入无水乙醇2 mL，室温暗处反应20 min，取上清液在517 nm处测光密度值为Aj；以2 mL 0.04 g/L DPPH无水乙醇和2 mL无水乙醇为参比，光密度值为A0[16]。对DPPH自由基的清除率 K=[1－（Ai－Aj）/A0]×100%。

2）蛋清肽对羟自由基的清除。参考牛慧慧等方法[3]。取1 mL 1.25 mmol/L邻二氮菲乙醇溶液于试管中， 加入 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL 蒸馏水于试管中，用pH 7.4 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液补至2 mL。混匀，加入1 mL 1.25 mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀，加入 1 mL 0.025%双氧水，37℃水浴 60 min，536 nm测损伤管光密度值（A损）。未损伤管以相同体积蒸馏水代替双氧水（A未），样品管以蛋清肽代替损伤管相应体积的蒸馏水（A样），使其终质量浓度分别为 0.308 4﹑0.616 8﹑0.925 2﹑1.233 6、1.54 2 mg/mL，其它同损伤管。加入3 mg/mL VC，使终质量浓度分别为 0.03﹑0.06﹑0.09﹑0.12﹑0.15 mg/mL，同法操作。

式中，KOH为OH清除率；A1为样品管的光密度值；AS为损伤管光密度值；AW为未损伤管光密度值。

3）蛋清肽对超氧阴离子自由基的清除。参考李艳红等方法[17]。 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL 1 mg/mL蛋清肽于试管中，用0.1 mmol/L pH 8.2 Tris-HCl缓冲液补至2.8 mL，加入0.1 mL 0.018 mmol/L邻苯三酚，迅速混匀并开始计时，320 nm处测定光密度值，每隔30 s测定A320，共2 min。以0.1 mL蒸馏水和2.8 mL 0.1 mmol/L pH 8.2 Tris-HCl缓冲液为对照。VC同法操作。制作光密度值随时间变化回归方程，斜率为邻苯三酚自氧化速率v。

式中，K 为清除率；v0（ΔA0/Δt）为对照邻苯三酚自氧化速率（ΔA320/min）；v1（ΔA1/t）为样品邻苯三酚自氧化速率（ΔA320/min）。

4）蛋清肽总还原力的测定。参考贾俊强等方法[18]，分别取 0.05﹑0.1﹑0.15﹑0.2﹑0.25 mL 0.2 mg/mL 蛋清肽于试管中，用0.2 mol/L pH 6.6磷酸缓冲液补至1 mL，加入0.75 mL 1%铁氰化钾，混匀后50℃水浴20 min，2 mL 10%三氯乙酸终止反应，3 000 r/min离心10 min。取上清液2 mL，加入0.5 mL 0.1%FeCl3混匀，700 nm测定光密度值。VC同法操作。

5）蛋清肽对脂质过氧化的抑制。参考吕英华方法[19]。硫代巴比妥酸（TBA）法测定。样品管加入 2、4、8、16、32 mg/mL VC 1 mL 和 0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mL蛋清肽，用0.1 mol/L pH 7.4磷酸缓冲液补至1.0 mL，加入 1.0 mL 400 μmol/L 硫酸亚铁，最后加蛋黄1.0 mL，混匀后于37℃水浴反应60 min，TCATBA-HCl溶液2 mL，混匀后沸水浴加热15 min，迅速冷却后，4 000 r/min离心10 min，取上清液在535 nm处测光密度值As。对照管以缓冲液代替蛋清肽，测得为Ac。空白管加入2 mL缓冲液，1.0 mL 400 μmol/L硫酸亚铁，测得光密度值A0。

式中，I为抑制率；Ac为对照管光密度值，As样品管光密度值，A0为空白管光密度值。

1.2.6 特性试验

1）pH对羟自由基清除率的影响。取5 mL蛋清肽，调 pH 至 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，用蒸馏水补至相同体积，37 ℃水浴 30、60、90、120 min， 分别测定羟自由基清除能力[20]。

2）温度对蛋清肽清除·OH能力的影响。取蛋清肽 8 mL，调至 pH 3，用 pH 7.0 Tris-HCl缓冲液补至相同体积，分别在 60、70、80、90 ℃下加热，30、60、90、120、150 min 时测定清除·OH 能力[21]。

3）蛋清肽溶解性测定。2 mg甘氨酸稀释定容至100 mL， 分别加入 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2 mL 甘氨酸溶液，用水补至2 mL，充分混匀，加入1 mL显色剂，混匀，沸水浴15 min，迅速冷却，测定光密度值，制作甘氨酸标准曲线[22]。取样品5 mL，调至pH 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，定至 10 mL，搅拌 30 min，7 500 r/min离心15 min，取上清液2 mL，测定光密度值。以OD570表示溶解性大小，制作溶解性和pH曲线。

4）等电点测定。取5 mL蛋清肽稀释至10 mL，分别调 pH 至 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，660 nm 测定各溶液的透光率，作pH和透光率曲线[23]。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

选取风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶及胰蛋白酶进行酶活测定，以相同的总酶活对EWP进行单酶水解，各酶作用的条件见表1。

表1 蛋白酶的酶活及作用条件Tab.1 Activities and action conditions of protein enzymes

酶对底物具有一定的特异性，底物不同则蛋白酶水解产物的结构不同，因此，酶的种类及酶水解蛋白的能力对产物的抗氧化和特性具有较大的影响[24-25]。由图2可知，风味蛋白酶对DPPH清除率基本上维持在最高水平，其次为中性蛋白酶，胰蛋白酶与碱性蛋白较为接近，这可能是风味蛋白酶作用位点较为广泛，能暴露出更多的活性位点，从而增强抗氧化作用。因此选择风味蛋白酶作为蛋清肽的最佳水解酶。随酶解时间的延长，由于底物减少、产物抑制效应及少量肽链被降解，导致蛋清肽得率降低，抗氧化性降低，同时考虑到试验周期等原因，酶解时间选择90 min。

图2 蛋白酶的筛选Fig.2 Selection of protein enzymes

2.2 单因素实验

酶活对蛋清肽清除DPPH的影响见图3（a）。酶活对DPPH清除率有极显著影响（p＜0.01），当逐渐增加酶活时，其对DPPH清除率增加，这是因为在蛋清体积分数一定的条件下，产物生成率取决于酶活，酶活越大，EWP与酶的接触机会越多，但酶活太大则增加了成本且生成的肽易被降解[26]，因此选择酶活1 000 U。蛋清体积分数对蛋清肽清除DPPH率的影响见图3（b）。蛋清体积分数对DPPH清除率有极显著影响（p＜0.01），蛋清体积分数较低时，酶与其作用几率较低，反应速度慢，当增加蛋清体积分数时，反应平衡右移，有利于产物增加。但蛋清体积分数较大时，清除率出现下降趋势，这是因为此时酶活不再充足，同时EWP间易产生交联聚合现象，溶液粘度过大，影响EWP的扩散及酶与蛋清的接触和有效反应，反应速度减慢[27]，因此选择EWP含量为8%。pH对蛋清肽清除DPPH的影响见图3（c）。 pH 对 DPPH 清除率有极显著影响（p＜0.01），酶的构象和解离状态及EWP解离状态均会随溶液pH的变化而变化，影响酶与底物的催化。随pH逐渐增大，对DPPH清除率逐渐降低，pH 6.5时为最低值，为34.24%，随pH继续增大，对DPPH清除率逐渐增加并趋于稳定。因此选择pH=5.5。温度对蛋清肽清除DPPH的影响见图3（d）。温度对DPPH清除率有极显著影响（p＜0.01）。温度对酶促反应速度的影响有两个方面，一方面提高温度可增加反应速度，另一方面随温度的升高，酶失活速度也随之增加。随温度的升高，其对DPPH清除率随之增加，40℃达到最大值，为40.17%，随后继续增大温度，清除率先下降后上升，可能是生成的多肽重新被酶水解，随温度的继续升高，又逐渐产生的缘故，因此温度选择为40℃。

图3 单因素实验Fig.3 Orthogonal test

2.3 正交试验

方差具有齐性（sig=0.12＞0.05），可进行正交分析。正交试验设计见表2。由表3可知，各因素主次顺序依次为 D＞A＞B＞C，即酶活＞pH＞温度＞蛋清体积分数，最佳组合为A1B3C2D3，即pH 5、温度45℃、蛋清肽质量浓度8 g/dL，酶活1 125 U。由表4可知，A、B、D因素影响极显著，C因素影响显著，与极差分析一致。但最佳组合未出现在正交表中，需要对其进行验证[29]。在最佳条件下重复三次，清除率分别为53.1%、53.27%、53.45%，平均为53.27%，高于表3最佳3号中的50.71%。RSD为0.3285%，重现性好。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment

序号A B C D DPPH清除率/%k146.30745.52345.37343.753 k244.3845.02745.68745.337 k346.0746.20745.69747.667 R 1.9271.180.3243.914较优水平A1B3C2D3主次因素D＞A＞B＞C

表4 方差分析Table 4 Variance of analysis

2.4 抗氧化试验

VC及蛋清肽对羟自由基的清除分别如图4（a）和 （b）。VC的 IC50=0.092 mg/mL， 蛋清肽 IC50=1.24 mg/mL，约为后者的13倍，说明VC对羟自由基清除率远强于蛋清肽，后者在0.308 4～1.542 mg/mL范围内，随质量浓度增大其对羟自由基的清除率逐渐增大。VC及蛋清肽对超氧阴离子自由基的清除率见图 4（c）和（d），VC 的 IC50==0.021 6 mg/mL，蛋清肽的IC50==0.054 mg/mL，约为后者的2.5倍，说明VC对超氧阴离子自由基清除率稍强于蛋清肽，后者在0.089～0.443 mg/mL范围内随质量浓度增大，其对超氧阴离子自由基的清除率先逐渐增大，后趋于稳定。VC及蛋清肽的总还原力见图4（e）和（f）。还原力表示物质提供电子的能力，还原能力越强，越易提供电子使自由基成为稳定物质，从而中断连锁反应[30-31]。随VC及蛋清肽质量浓度不断增加，其总还原力均几乎成线性增加，这说明蛋清肽还原能力具有较好的量效关系[32]，但前者强于后者。VC及蛋清肽对脂质过氧化的抑制率见图4（g）和（h），卵黄中不饱和脂肪酸在Fe2+催化下，能诱发过氧化生成烷氧基（LO·）和烷过氧基（LOO·），进一步发生链式反应。在加热的条件下，过氧物可与TBA反应生成红色化合物，532nm处具有光吸收[33]。当VC在0.667～10.667 mg/mL范围时，其对脂质过氧化具有抑制作用，但抑制作用随VC质量浓度不断增加反而下降；另外，试验中还发现当VC质量浓度在0.667～10.667 μg/mL范围时，其对脂质过氧化具有促进作用，这可能是VC在讲Fe3+还原为Fe2+时产生了自由基，对脂质体氧化起到了促进作用[34]。蛋清肽对脂质过氧化的抑制作用无一定规律，在0.086～0.341 mg/mL范围内，抑制作用随其质量浓度增加而增加，0.341～1.371 mg/mL范围内反而减弱。

图4 抗氧化试验Fig.4 Antioxidant experiment

2.5 蛋清肽的特性研究

由图5（a）可知，不同pH条件下蛋清肽对羟自由基的清除作用随时间几乎不发生变化，这说明蛋清肽对羟自由基清除率对pH稳定性较好。溶解性是蛋白质功能性质的最重要因素之一，蛋白质溶解性与电荷、疏水性有关，高电荷、低疏水性可提高溶解性。EWP酶解可提高电荷数目，疏水性逐渐暴露，但前者作用大于后者，因此，整体上增加了蛋白质的溶解性[35]。由图5（b）可知，蛋清肽溶解性随pH增加而增大，说明溶解性对pH的稳定性较差。由图6（a）可知，蛋清肽抗氧化作用随反应时间的延长和温度逐渐升高逐渐下降，这主要是高温不利于蛋清肽向产物的转化，且易使EWP变性聚集。等电点时，蛋白质、肽的浊度最高。由图6（b）可知，蛋清肽在pH 3时透光率最低，即浊度最大，说明其等电点在3左右，只有在酸度较大情况下易于析出，因此可广泛应用于食品行业[36]。

图5 pH对蛋清肽羟自由基清除率及蛋清肽溶解性的影响Fig.5 Scavenging hydroxyl radical and solubility of egg white peptide with different pH

图6 温度对蛋清肽羟自由基清除率的影响及等电点测定Fig.6 Scavenginghydroxylradicalfordifferenttemperature and isoelectric point of egg white peptide

3 结语

1）风味蛋白酶为蛋清抗氧化肽的最佳制备酶，酶解时间选择90 min。最佳工艺为:pH 5、45℃、蛋清体积分数8%，酶活1 125 U。此条件下对DPPH自由基平均清除率为53.273%。

2）在 0.308 4～1.542 mg/mL、0.089～0.443 mg/mL范围内，蛋清肽对羟自由基、超氧阴离子自由基均具有一定的清除能力，清除率随其含量的增大而增加，但清除作用低于VC。在0.667～10.667 mg/mL范围内，蛋清肽对脂质过氧化的抑制作用随其含量增加而减小，在0.667～10.667 μg/mL范围内反而具有促进脂质过氧化作用。蛋清肽等电点在pH 3左右，对羟自由基清除率随温度增加逐渐下降；在pH 2～10范围内，溶解度变化较大。

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