酒酒球菌31MBR的β-D-葡萄糖苷酶活性

李亚辉， 崔禾苗， 董 梅， 樊明涛

（西北农林科技大学 食品学院，陕西 杨凌 712100）

优质葡萄酒不仅表现在外观、口感等方面，更体现在香气方面，香气是影响葡萄酒质量的主要因素之一[1]。葡萄浆果中存在着结合态和游离态两大类呈香物质[2-3]。结合态呈香物质的含量比游离态呈香物质要丰富得多，并且大部分以糖苷的形式存在。结合态呈香物质虽没有香气，但经过分解可以释放出游离态香气物质，大大增强和改善葡萄酒的风味[4-5]，因此结合态呈香物质又被称为风味前体物质是葡萄酒香气的一个重要来源。葡萄酒中糖苷类物质的分解主要分为弱酸水解和酶促水解[6-8]。酸解发生缓慢，对温度、pH等均有严格的要求，且会影响释放出物质的性质，产生不良风味[9-10]，因此不适于在葡萄酒酿造工业中应用。而酶解则是一种接近于自然、温和的水解方法，极具商业化应用前景。在葡萄酒酿造中一般采用酶解的方法来分解风味前体物质增强葡萄酒香气[9，11-12]。糖苷类物质的酶解需要多种酶的共同参与，其中β-D-葡萄糖苷酶是结合态香气释放的关键酶[3]。

微生物中β-D-葡萄糖苷酶酶活高的菌株主要是霉菌[13]，而乳酸菌中也有一些菌株具有较高的糖苷酶活性。酒酒球菌31MBR是在我国广泛应用的一株商业葡萄酒酿造乳酸菌，具有良好的苹果酸乳酸发酵性能。但目前关于该菌β-D-葡萄糖苷酶活性的研究还未见报道。作者对酒酒球菌31MBR进行了β-D-葡萄糖苷酶活的定位测定、不同生长时期酶活的测定以及酶的诱导测定。这对开发酒酒球菌31MBR的新功能，增强葡萄酒的香气、提高中国地区葡萄酒的品质具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酒酒球菌31MBR:西北农林科技大学葡萄酒学院微生物实验室保藏。

对-硝苯-β-葡萄糖苷（p-NPG）:美国 Sigma公司；葡萄糖、纤维二糖、熊果苷:美国 Amersc公司；其他试剂均为西陇化学试剂。

ATB培养基:蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L， 葡萄糖 10 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，盐酸半胱氨酸 0.5 g/L，番茄汁 250 ml/L，pH值调至4.8，121℃灭菌20 min。

DH-420A电热恒温培养箱:北京科伟永兴仪器有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司；HS-840μ型水平层流单人净化工作台:苏州净化设备有限公司；UV-3802H紫外可见分光光度仪:上海尤尼柯仪器有限公司；VC-130超声波细胞破碎仪:美国Sonics&Materials公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化及生长曲线测定 将冷冻保藏的31MBR菌株于ATB培养基中25℃静置培养，然后在同样培养基中再转接2次，分别培养2 d。将活化好的菌悬液以1%接种体积分数转接至100 mL ATB培养基中，25℃静置培养，每隔4 h测定一次OD600值，直至OD600值稳定。

1.2.2 β-D-葡萄糖苷酶活测定方法 酶活测定方法参照Barbagallo[14]略作修改。0.5 mL处理样品与0.5 mL 2×底物磷酸柠檬酸缓冲液（pH 5.0，p-NPG 5 mmol/L）混合均匀，30℃水浴反应1 h，离心10 min（4℃，10 000 g）得上清液，上清液中加入2 mL Na2CO3（1 mol/L）终止反应，最后在400 nm下比色。标准曲线由不同浓度（0～200 μmol/L）的对硝基苯酚（p-NP）与 Na2CO3（1 mol/L）混合在 400 nm 下比色获得。菌体干重由50 mL菌液离心、烘干、称重获得。酶活单位定义为:p-NP μmol/（g·min）。

1.2.3 31MBR不同部位酶活的测定 将酒酒球菌31MBR培养至36 h（对数生长末期），按下列步骤分别获得菌液上清液、完整细胞、细胞破碎液上清液和细胞破碎液沉淀4个处理样品。取1 mL菌液离心10 min（4℃，5 000 g），得菌体和培养基上清液。菌体用NaCl（150 mmol/L）洗涤两次得完整细胞。完整细胞悬浮于1 mL PBS buffer（NaCl 140 mmol/L；KCl 2.7 mmol/L；Na2HPO410 mmol/L；KH2PO41.8 mmol/L；pH 7.4），超声波 100 W 破碎 10 min，然后离心10 min（4℃，10 000 g）得破碎上清液和破碎沉淀。按照1.2.2方法分别测不同样品的酶活。

1.2.4 31MBR不同生长阶段酶活的测定 分别在对数生长中期（20 h）、对数生长末期（36 h）和稳定期（50 h）取样，按照1.2.3方法分别测菌液上清液、完整细胞和细胞破碎液酶活。

1.2.5 31MBR葡萄糖苷酶的诱导测定 分别以葡萄糖（10 g/L）、纤维二糖（10 g/L）、熊果苷（10 g/L）、葡萄糖（5 g/L）加熊果苷（5 g/L）和葡萄糖（5 g/L）加纤维二糖（5 g/L）作为培养基中的碳源，培养酒酒球菌31MBR至对数生长末期（36 h），按照1.2.3方法分别测菌液上清液、完整细胞和细胞破碎液的酶活。

2 结果与分析

2.1 酒酒球菌31MBR生长曲线

由图1可知，8～36 h为31MBR的对数生长期，36 h之后为稳定期。因此作者分别在20 h（对数生长中期）、36 h（对数生长末期）和 50 h（稳定期）取样测定31MBR不同生长时期的酶活。

图1 31MBR生长曲线Fig.1 Growth curve of 31MBR

2.2 31MBR不同部位的酶活

图2显示了酒酒球菌31MBR的β-D-葡萄糖苷酶定位测定结果。菌液上清液中酶活很低，几乎为零，说明在31MBR生长过程中分泌到胞外的β-D-葡萄糖苷酶很少，该酶不是胞外酶。细胞破碎后，细胞结构被破坏，酶蛋白释放出来，离心得到的上清液和沉淀中均有酶活，说明β-D-葡萄糖苷酶主要为胞内酶。而破碎液上清中的酶活显著高于沉淀中的酶活，说明了胞内的β-D-葡萄糖苷酶为可溶性的非膜结合酶，而另一部则可能是膜结合酶。值得注意的是，31MBR的完整细胞也具有一定的酶活，这可能是细胞通过磷酸烯醇式丙酮酸转移酶系统来实现的[15-17]。完整细胞具有β-D-葡萄糖苷酶活对于葡萄酒酿造具有重要意义，可以使该乳酸菌在实现降酸的同时，进一步释放结合态的风味物质，改善葡萄酒的香气。

图2 31MBR β-D-葡萄糖苷酶活定位Fig.2 Enzyme localization of 31MBR

2.3 31MBR不同生长阶段的酶活

图3显示了31MBR菌液上清液、完整细胞和细胞破碎液在对数生长中期（20 h）、末期（36 h）和稳定期（50 h）的酶活。由图3可知，菌液上清液在三个不同时期的酶活都几乎为零，这和结果2.2一致，说明该酶不是胞外酶，且酶的位置没有随着生长时期的变化而发生变化。同时可以看出，完整细胞和破碎液的酶活在对数生长中期最高，且随着生长时间的延长呈下降趋势。

图3 31MBR不同生长阶段酶活Fig.3 Enzyme activity at different period of 31MBR

2.4 31MBR糖苷酶的诱导

微生物来源的糖苷酶除了是结构酶外，还可能是在碳源诱导下产生的诱导酶。图4显示了31MBR β-D-葡萄糖苷酶在不同碳源诱导下的实验结果。由图4可知，在有熊果苷作为碳源时菌液上清液的酶活显著高于其他试验组的酶活。这是因为熊果苷在分解产生葡萄糖的同时产生了对羟基苯酚，和对硝基苯酚一样在碱性条件下产生黄色而造成酶活测定结果较高。菌液上清液在不同试验组中较低的酶活和酶活定位的结果一致，说明了糖苷酶的位置没有随着碳源的变化而发生变化。

图4 31MBR β-D-葡萄糖苷酶的诱导Fig.4 Induction of β-D-glucosidase activity from 31MBR

对于细胞破碎液来说，以葡萄糖作为碳源时有较高的酶活，这说明了31MBR的胞内β-D-葡萄糖苷酶是结构酶。但在有纤维二糖或熊果苷作为碳源时其酶活显著高于以葡萄糖作为碳源时的酶活，且有熊果苷作为碳源时的酶活要高于有纤维二糖作为碳源时的酶活，说明在含糖苷键碳源的诱导下酶活会有不同程度的提高。这种现象可能是葡萄糖代谢产物的阻遏作用造成的。完整细胞呈现出和破碎液完全一样的趋势。

3 结语

酒酒球菌31MBR的β-D-葡萄糖苷酶为胞内酶，且主要为可溶性的非膜结合酶。31MBR的完整细胞具有一定的酶活，对于葡萄酒酿造具有重要意义。31MBR的β-D-葡萄糖苷酶位置不随生长时期和碳源的变化而发生变化。酶活在对数生长中期最高且随着生长时间的延长呈下降趋势。该酶为结构酶，但在纤维二糖和熊果苷的诱导下酶活有不同程度的提高。

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