柱前衍生-高效液相色谱法测定丙戊酸钠血药浓度

周春华，张志清，李飞高，亢泽坤，李敬瑄，张雪宁

（河北医科大学第二医院药学部，河北石家庄 050000）

柱前衍生-高效液相色谱法测定丙戊酸钠血药浓度

周春华，张志清*，李飞高，亢泽坤，李敬瑄，张雪宁

（河北医科大学第二医院药学部，河北石家庄 050000）

目的 建立柱前衍生-高效液相色谱法测定血清样品中丙戊酸钠的含量。方法以Diamonsil C18（4.6×250mm 5μm）为色谱柱，流动相为甲醇-水（87∶13，V/V），检测波长为245nm；流速为1.0mL/min；柱温25℃。样品酸化提取后经α-溴代苯乙酮衍生化后分析，环己烷羧酸为内标。结果标准曲线线性相关系数（r）为0.999 3，线性范围15.0～180.0μg/mL，平均回收率为103.2％，日内、日间相对标准差均小于10％，最低检出浓度为0.3μg/mL。结论该方法简便、准确，适合于临床血药浓度监测。

丙戊酸；色谱法，高压液相；血药浓度

丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）是临床上常用的抗癫痫药物［1］，当其血药浓度＞100μg/mL时，其不良反应增加而疗效无明显增加，是血药浓度监测的常检药物，有效血药浓度为50～100μg/mL，血药浓度与疗效及毒性反应密切相关，是需进行常规监测的药物之一［2-4］。由于VPA在紫外区无特征吸收，不易直接检测，临床上常用气相色谱测定，但存在萃取过程药物挥发的问题。近年来，采用柱前衍生-高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法衍生化测定VPA血药浓度的报道［5-6］也较多，但多采用的衍生化试剂、条件及方法各不相同。本研究采用α-溴代苯乙酮为衍生化试剂，环己烷羧酸为内标，衍生化过程较简易快速，紫外条件下测定显示，样品及内标峰性良好，无内源性物质干扰，该方法适用于VPA血药浓度常规监测。

1 仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪，包括Empower Pro工作站，Waters-515泵；Waters-486紫外检测器；7725i进样阀（RHEDYNE）；电子天平（Sartorius，CPA2250）；离心机（LD5-10，北京医用离心机厂）；涡旋混合器（XW-80A，上海精科实业有限公司）；数控恒温水浴（氮吹仪专用，KL512J，北京康林科技有限责任公司）。抽滤泵（AP-01P，天津市协同仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ-300B，昆山市超声仪器有限公司）。

丙戊酸钠标准品（批号100963-201101，中国食品药品检定研究院）；α-溴代苯乙酮标准品（批号LA50LO9，瑞士J＆K Scientific公司）；环己烷羧酸标准品（批号LU70L15，瑞士J＆K Scientific公司）；甲醇（批号120301，色谱纯，天津康科德科技有限公司）；乙腈（批号101203，色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；正己烷（批号20091118，分析纯，宜兴市试剂二厂）；氨水（批号20031018，分析纯，张家口市化学试剂厂）；三乙胺（批号20111220，分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；硫酸（批号19981116，分析纯，北京北化精细化学品有限责任公司）；蒸馏水（自制，二次蒸馏）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［5］：色谱柱DiamonsilTMC18柱（250mm×4.6mm，5μm，XB-C18）；流动相甲醇-水（87∶13，V/V）；流速1.0Ml/min；检测波长245nm；柱温25℃；进样量20μL；内标物环己烷羧酸。

2.2 溶液的制备：储备液配制，精密称取丙戊酸钠200mg，加入25mL容量瓶中，蒸馏水定容，作为丙戊酸钠储备液。标准溶液配制，取丙戊酸钠储备液适量，用蒸馏水稀释成浓度分别为150、300、450、750、1 000、1500、1 800mg/L的标准溶液。

内标溶液配制，精密称取环己烷羧酸12.8mg，加入100mL容量瓶中，0.5mol/L氨水定容，摇匀，得浓度为123.90mg/L的内标溶液。

衍生剂溶液的配制，精密称取α-溴代苯乙酮250mg，加入25mL容量瓶中，乙腈定容，摇匀，得浓度为10.00g/L的衍生剂溶液。

2.3 血清样品处理：取血清常温下融化，精密吸取180μL，加入内标溶液200μL和1mol/L硫酸200μL，混匀，加提取液正己烷3mL涡旋混合2min，离心（4 000r/min）5min，转移上层有机相2.5mL至玻璃离心管中，加入20μL三乙胺和20μL衍生剂溶液，水浴氮气吹干（水浴温度50℃），加入100μL甲醇溶解后进样。

2.4 专属性考察：按“2.3”项方法操作制备血清样品进样测定。在选定色谱条件下VPA与内标完全分离，VPA和内标的保留时间分别为8.5min和6.5 min且分离良好，血浆内源性物质对测定无干扰，结果见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血清；B.血清模拟样品；C.给药后血清样品；1.内标；2.丙戊酸钠Figure 1 HPLC chromatogram A.Blank plasma；B.Blank plasma with sodium valproate；C.Plasma sample；1.Internal standard；2.Sodium valproate

2.5 标准曲线制备：取空白血清常温下融化，精密吸取180μL，加入系列浓度的丙戊酸钠溶液20μL，内标溶液200μL，1mol/L硫酸200μL，混匀，使血清中丙戊酸钠的浓度依次为15、30、45、75、100、150、180mg/L，加入提取液正己烷3mL，涡旋混合2min，离心（4 000r/min）5min，转移上层有机相2.5mL至玻璃离心管中，加入20μL三乙胺和20μL衍生剂溶液，水浴50℃放置10min，氮气流吹干，加入100μL甲醇复溶后进样。测得的丙戊酸钠峰面积与内标峰面积之比（Y）对血清药物浓度（C）进行线性回归，得到标准曲线方程为Y=0.009 38C+0.024 72，（线性范围为15～180mg/L，r=0.999 3）。

2.6 精密度试验：日内精密度，取空白血清180μL，分别加入低（300mg/L）、中（750mg/L）、高（1 500mg/L）3种浓度的丙戊酸钠标准溶液20μL，使血清药物浓度分别为30、75、150mg/L。按血清样品处理方法处理并测定，记录色谱峰面积。一日内重复配制并测定5次，并计算日内相对标准差（relative standard deviation，RSD）值。

日间精密度，取空白血清180μL，加入低（300mg/L）、中（750mg/L）、高（1 500mg/L）3种浓度的丙戊酸钠标准溶液20μL，使血清药物浓度分别为30、75、150mg/L。按血清样品处理方法处理并测定。连续测定5d，并计算日间RSD值。

低、中、高3个浓度血清样品的日内及日间精密度结果见表1。RSD在15.00％以内，结果表明，丙戊酸钠溶液在5d内稳定，本法精密度较好。

表1 精密度实验结果Table 1 Results of precision test

2.7 稳定性试验：低温保存稳定性，按“2.6”项制备低、中、高浓度血清样品，于-40℃低温保存5d，按血清样品处理方法处理并测定，计算RSD。丙戊酸钠血清样品低温保存稳定性结果见表2。结果表明低温保存对测定结果无影响。

反复冻融稳定性，按“2.6”项制备低、中、高浓度血清样品，反复冻融3次后按血清样品处理方法处理并测定，计算RSD。丙戊酸钠血清样品反复冻融稳定性结果见表2。结果表明，反复冻融对测定结果无影响。

处理样品放置稳定性，按“2.6”项制备低、中、高浓度血清样品，按血浆样品处理方法处理后。分别于0，1，2，3，4h进行测定，计算RSD。处理样品低温保存稳定性结果见表2，相对标准偏差为0.42％，结果表明处理样品后放置一定时间对测定结果无影响。

表2 稳定性实验结果Table 2 Results of stable test

2.8 回收率试验：按“2.6”项制备低、中、高浓度血清样品。依据标准曲线计算其浓度，并与实际浓度比较得方法回收率。低、中、高3种浓度模拟血清样品的回收率97.36％～107.10％之间，RSD均在在3.4％以下，结果见表3。

表3 方法回收率试验结果Table 3 Results of recovery test（n=3）

3 讨论

本研究采用高效液相色谱法紫外检测器测定血药浓度，选用与VPA的结构相似物环己烷羧酸为内标［3］，该方法进样量小，样品处理简单，杂质干扰少，方法灵敏度高，可作为VPA血药浓度测定方法。

本研究根据相似相容原理，分离提取过程采用正己烷为提取液，且正己烷为重蒸过的，可使提取率达到最高而且稳定。丙戊酸分子结构中不含有紫外特征吸收基团，不能用高效液相色谱法直接测定，因此，将其连接上有紫外吸收的基团是本研究的关键：在三乙胺的催化下，α-溴苯乙酮与丙戊酸及内标环己烷羧酸发生衍生化反应，三乙胺作为催化剂能中和反应中生成的溴化氢，阻止反应向逆反应方向进行，使VPA酯化完全；同时也可作为改性试剂，起到改善色谱峰峰形的作用［6］。流动相为甲醇和水，不需使用缓冲液等盐类物质，有利于保护色谱柱。

VPA是常用的广谱抗癫痫药，VPA进入人体后，转变成丙戊酸而发挥作用，故服用VPA后血药浓度监测以丙戊酸浓度为准。目前，丙戊酸常用的血清药物浓度监测方法有HPLC法和FPIA法。相对于FPIA法的仪器昂贵、试剂盒保质期短等缺点，HPLC法的准确、仪器试剂便宜易得等优点，更适合一般医院的临床血药浓度检测工作。

［1］陈云飞.托吡酯与丙戊酸钠治疗成人癫痫的疗效比较［J］.河北医科大学学报，2011，32（11）：1313-1314.

［2］刘亦伟，王长连，黄品芳.HPLC法测定人血清中丙戊酸的含量［J］.海峡药学，2004，16（5）：143-144.

［3］廖卫平，朱凯云，陆雪芬.高效液相色谱法测定生物样品中丙戊酸浓度［J］.药物分析杂志，1990，10（6）：347-349.

［4］邹高远，黄英，黄茂植，等.毛细管柱气相色谱法测定血浆中的丙戊酸浓度［J］.华西药学杂志，2002，17（1）：51-52.

［5］孙增先，张骞锋，周金玉，等.柱前衍生-高效液相色谱法测定丙戊酸钠血药浓度［J］.中国临床药学杂志，2004，13（2）：93-96.

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（本文编辑：赵丽洁）

表2 2组依从性及痛苦程度比较（n=110，例数，％）

3 讨论

3.1 心理干预有利于提高患者依从性并减轻焦虑、抑郁情绪及痛苦：观察组实施了心理干预，使患者手术前后的焦虑、抑郁情绪明显减轻或消失；而对照组术前、术后变化不明显，虽有所改善，但差异无统计学意义。2组在健康教育达标率以及患者的依从性和术后痛苦程度上差异有统计学意义。说明运用心理干预可有效地减轻鼻腔手术患者的焦虑、抑郁情绪，减轻术后痛苦，并可提高其依从性。

3.2 心理干预有利于培养护理人员服务理念：本研究强化了责任护士应具备丰富的专业知识、心理护理方面的知识以及道德修养。应具有爱心、诚心、热心及责任心，站在患者的角度理解患者的感受，树立为患者着想的服务理念。

3.3 非语言性干预在心理干预中的作用不可忽视：语言与肢体语言的配合，特别是手的触摸能带来积极效果，促进人与人之间的沟通交往。通过触摸人体分泌一种有助于放松的激素，从而消除紧张；触摸还会增加机体后叶催产素的分泌，此激素使人产生爱、信任和亲密的感觉，是一种无声的语言，是一种很有效的沟通方式，触摸可以表达关心、体贴、理解、安慰和支持［6］。

3.4 心理干预是健康教育中重要的一环：在护患沟通方面也提出更高的要求，通过对患者进行有效的心理干预，可减轻患者的焦虑、紧张情绪，调动其主观能动性，使之能够积极配合治疗。同时通过有效沟通，使护患关系得到改善。护士的服务更加主动周全［7］。

3.5 心理干预应贯穿于整个护理过程：心理干预非一蹴而就，应贯穿全程；沟通时要把握好时机，在患者需要时进行，否则达不到满意效果。在医疗技术相对发达、高学历人才济济的今天，医院与医院之间的差距并不在一些硬件设施的配备上，而在于软件即医护人员的服务水平［8］。我们通过对患者术前、术后进行有针对性的心理干预，既能缓解患者的焦虑、抑郁情绪，又可提高患者的依从性，保证了健康教育的有效性，值得在临床上推广应用。

【参考文献】

［1］刘云，周卫民.胸部术后患者综合护理干预的效果评价［J］.中国实用护理杂志，2012，28（2）：35.

［2］李小妹.护理学导论［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2007：17.

［3］郭念锋.心理咨询师（三级）［M］.北京：民族出版社，2005：60.

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［6］潘孟昭.护理学导论［M］.北京：人民卫生出版社，2001：111.

［7］高玲，刘艳红.心理护理在开胸手术患者中的应用［J］.吉林医学，2006，21（12）：1492-1493.

［8］张春舫，张燕.临床护理人员共情能力的调查分析［J］.河北医科大学学报，2011，32（10）：1119，1122，1129，1134.

（本文编辑：赵丽洁）

DETERM INATION OF SODIUM VALPROATE IN SERUM BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY AFTER PRE-COLUMN DERIVATIZATION

ZHOU Chunhua，ZHANG Zhiqing*，LIFeigao，KANG Zekun，LIJingxuan，ZHANG Xuening
（Department of Pharmacy，the Second Hospital of Hebei Medical Uniuersity，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To establish amethod for determining sodium valproate in serum by high performance liquid chromatography（HPLC）after pre-column derivatization.M ethods The analytical column was Diamonsil C18 column（250mm×4.6mm，5μm）.The mobile phase consisted ofmethanolwater（87∶13，V/V）at the flow rate of1.0mL/min.The detection wave length was set at245nm and the column temperature was set at 25℃.The samples were extracted after being acidified，then derived with α-bromoacetophenone before analysis.Cyclohexane carboxylic acid was used as the internal standard. Results The liner correlation of the standard curvilinear equation was r=0.999 3 with a linear range of 15.0-180.00μg/mL.Themean relative recovery was 103.2％.The intra-day and the inter-day relative standard deviation were less than 10％.The lowest limit of detection of valproate was 0.3μg/mL. Conclusion This method was convenient and accurate for the blood concentration monitoring of therapeutic drugs.

valproic acid；chromatography，high performance liquid；plasma concentration

R969.11

A

1007-3205（2013）11-1422-04

2013-06-16；

2013-08-03

2012年河北省医学科学研究重点课题计划（20120082）

周春华（1980-），男，河北唐山人，河北医科大学第二医院药师，理学硕士，从事药动学及临床药学研究。

*通讯作者。E-mail：zhangzhq@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.11.023